通过嵌入式打印技术将图案化碳纳米管封装在PVA-SbQ水凝胶中，用于制备先进的生物相容性器官贴片

《Materials & Design》：Encapsulation of patterned carbon nanotube in PVA-SbQ hydrogels via embedded printing for advanced biocompatible organ patches

　　张康利|沈晨宇|申在明|迪克西特·卡蒂凯亚|库马尔·希滕德拉|张宏伟|刘大晨|卢庆业|陈刚|李贤在|金基英|胡金光
中国江苏省南通市南通大学医学院基础医学研究中心，邮编226001

**摘要**
将导电材料整合到水凝胶基质中在生物医学应用中具有巨大潜力。然而，传统方法通常直接将导电材料混合到水凝胶基质中，这可能会影响其功能性和生物相容性。受“悬浮水凝胶的自由形态可逆嵌入”（FRESH）打印技术原理的启发，本研究提出了一种新方法，通过嵌入式打印将图案化的导电材料封装在高含水量水凝胶中。该方法旨在通过提高功能性同时保持生物相容性来克服传统方法的局限性。通过精细的配方过程，将碳纳米管（CNT）和普鲁兰尼克（Pluronic）组成的导电墨水悬浮并打印在经过精心选择的含有苯乙烯吡啶基团（PVA-SbQ）的聚乙烯醇前体中，从而获得具有导电性、柔韧性和粘附性的复合材料。通过将导电图案内部封装，避免了导电材料与人体直接接触，使其适用于器官贴片等应用。本研究不仅证明了所提出方法的可行性，还展示了其在生物医学设备制造方面的潜在革命性。

**1. 引言**
可穿戴设备是一种佩戴在身体上的技术，通常设计为全天佩戴，并能够执行各种功能[1]、[2]。例如，健康监测设备用于跟踪和测量各种生理参数、活动或行为，为用户提供关于其健康和福祉的见解[3]、[4]、[5]。将水凝胶整合到可穿戴设备中可以带来多种优势，尤其是在生物相容性和柔韧性方面；因此，水凝胶和导电添加剂已被整合到可穿戴设备中，以捕获生物力学数据，如关节运动和肌肉收缩，这些数据在体育和康复中非常有用[6]、[7]、[8]、[9]。例如，叶等人设计了PVA-CNF离子导电有机水凝胶来检测身体运动的微妙变化[10]。然而，随着现代医疗标准的发展，体外佩戴的导电水凝胶设备无法满足一些更复杂和精确的体内检测需求，需要进一步探索人体内部器官佩戴的水凝胶[11]、[12]、[13]。这意味着需要进一步改进水凝胶的制备及其性能，如粘附性、生物相容性、灵敏度和导电性。

近年来，纳米颗粒和纳米材料因其独特的物理化学性质以及在药物递送[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、癌症治疗[20]、[21]、[22]、细胞行为调节[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、炎症和细菌抑制[28]、[29]、神经再生[30]和食品安全监测[31]等领域的广泛应用而受到广泛关注。同时，它们在导电软材料的开发中也起着关键作用，特别是在生物电子学、可穿戴设备和先进传感器领域。目前，提高水凝胶导电性的常用方法是将选定的导电纳米颗粒或聚合物分散到水凝胶前体溶液中[32]、[33]、[34]。例如，许多针对可穿戴设备的高质量研究通过将导电材料混合到水凝胶前体中，然后进行交联[7]、[35]、[36]来制备导电水凝胶。这种方法简单方便。然而，随着研究的进展，尚不清楚这种为外部可穿戴设备设计的水凝胶是否可以直接应用于体内[37]。一个关键问题是，导电纳米颗粒或聚合物与水凝胶表面的直接接触，特别是基于碳的纳米材料，可能会刺激器官并干扰其功能。因此，开发能够封装导电添加剂的水凝胶以避免直接接触是非常理想的。在这方面，赵等人做出了重要贡献，他们采用逐层打印策略将导电PEDOT:PSS沉积在水凝胶薄膜上，然后进行封装，从而防止导电墨水直接暴露于内部环境中[38]。

受赵工作的启发，我们开发了一种使用改进的“悬浮水凝胶的自由形态可逆嵌入”打印策略来封装导电墨水的水凝胶系统。这种称为FRESH的方法允许生物打印软细胞封装材料，如胶原蛋白或藻酸盐[39]、[40]、[41]。本文首次使用改进的FRESH方法（嵌入式打印）来创建封装导电碳纳米粒子的水凝胶。导电纳米粒子被打印到由临时凝胶状材料制成的支撑浴中。该支撑浴在打印过程中提供结构支持。嵌入式打印的关键创新在于使用高粘度、剪切变稀、光交联和生物相容的支撑浴。打印完成后，支撑浴可以快速交联而不损坏打印结构。与传统的FRESH打印方法不同，后者会去除支撑溶液并稳定其中的打印墨水，改进的嵌入式打印方法使用光固化来固化支撑溶液。因此，使用了含有苯乙烯吡啶基团（PVA-SbQ）的聚乙烯醇作为支撑浴，以满足嵌入式打印的要求[42]、[43]、[44]。未交联的PVA-SbQ溶液可防止打印的导电添加剂塌陷或变形。交联后，制备的生物相容性PVA-SbQ水凝胶具有优异的粘附性和机械性能以及高含水量。除了支撑浴外，挤出墨水对FRESH打印也很重要。为了改善导电添加剂的挤出效果，将CNT分散到普鲁兰尼克溶液中，在低温下，液态CNT/普鲁兰尼克溶液转化为室温下具有良好粘度和剪切变稀特性的固态墨水。

在这项工作中，通过嵌入式打印和光交联方法，成功制备了导电、可打印、粘附性强、柔韧且生物相容的高含水量水凝胶，该方法将图案化的CNT封装到PVA-SbQ聚合物中。导电且敏感的CNT图案被打印并封装在PVA-SbQ水凝胶中，以避免导电材料与器官和细胞直接接触。因此，CNT为PVA-SbQ水凝胶提供了导电性和灵敏度。PVA-SbQ水凝胶赋予CNT/普鲁兰尼克墨水柔韧性和生物相容性。此外，CNT/普鲁兰尼克和PVA-SbQ都具有可打印性和可图案化性。这种导电、粘附性强、生物相容且坚韧的水凝胶可以用作导电器官贴片。器官贴片可以贴在人体器官上，用于修复器官并检测器官运动。

**2. 结果与讨论**
**2.1. 设计原理**
受FRESH打印原理的启发，本研究探索了通过嵌入式打印将导电软材料整合到水凝胶基质中的方法。与传统方法不同，传统方法是将导电材料直接混合到水凝胶基质中，而这种方法是将图案化的导电材料封装在水凝胶内部。该方法包括通过将CNT与普鲁兰尼克结合来配制导电墨水。随后，将这种墨水打印并悬浮在精心选择的水凝胶前体中，该前体的粘度适合支持导电CNT/普鲁兰尼克墨水在其基质中的悬浮。这种支持墨水的能力使得可以在水凝胶支架中创建复杂的设计，以满足各种应用需求。如图1A所示，黑色普鲁兰尼克/CNT墨水根据设计的图案精细地打印在支撑浴中。与传统的FRESH打印方法不同，后者通常需要先固化打印墨水，然后去除支撑浴以获得所需的结构，我们的方法有所不同。在这里，首次使用PVA-SbQ作为支撑浴，在交联后促进导电墨水周围形成水凝胶基质。所得的水凝胶复合材料最外层由PVA-SbQ网络结构组成，通过SbQ基团的连接在光照下交联（图S1，支持信息）。在这个结构中，嵌入了由CNT和普鲁兰尼克组成的图案化导电纤维（图1B）。这种刻意的设计确保了导电材料在水凝胶网络中的封装，从而使水凝胶同时具有导电性和对生物相容性、粘附性和柔韧性至关重要的外部特性（图1C）。通过将导电图案限制在内部，水凝胶有效地避免了植入时导电材料与人体直接接触（图1D）。这一特性使得水凝胶可以直接附着在人体器官表面，提供柔韧性、生物相容性和导电性。此外，导电性有助于信号收集，特别是在器官活动轻微的情况下（图1D）。这种新技术产生了具有增强导电性能的无缝集成水凝胶复合材料，同时保留了水凝胶基质的柔软和柔韧性特性。这些特性使这项技术成为新型器官贴片的有希望的候选者，在生物医学等领域具有潜在应用。

**2.2. 打印演示**
获得的结果既证明了所提出设计的可行性（视频S1，支持信息），也验证了其有效性。在交联之前，黑色导电墨水通过针管挤出并悬浮在荧光色的PVA-SbQ水凝胶前体中。这种前体液体作为支撑浴，支持打印墨水，使其能够在液体中悬浮，并根据G-Code的指示打印成预定图案。所得的电路图案均匀且平滑地悬浮并打印在支撑浴中（图2和B）。随后，悬浮着打印纤维的水凝胶前体经过光交联，完成了溶胶-凝胶转变，从而将打印的图案化导电纤维封闭在水凝胶基质中（图2C和D）。交联后，水凝胶从最初的荧光状态转变为无色透明状态。重要的是，打印的电路图案在压缩变形时表现出抗断裂性（图2E和F）。除了圆形水凝胶包裹的电路图案外，水凝胶的形状和打印图案也可以根据设计要求进行定制。例如，可以通过这种方法制造由长方体水凝胶封装的较小直线（图2H）和用花形包裹的正方形图案（图S2，支持信息）。值得注意的是，打印导电纤维的形状和图案由设计参数决定（图S3，支持信息），而水凝胶基质的配置取决于光交联过程中投影仪投射的光的形状（图S4，支持信息）。水凝胶的光学透明度是一个重要特性。在整个打印和应用过程中，用户和研究人员必须密切监测水凝胶层下的情况。这一观察结果对于评估印刷材料的性能和完整性以及它们与周围环境的相互作用至关重要，强调了水凝胶必须具备优异透明度的必要性。如图2H所示，前体溶液和交联的PVA-SbQ水凝胶都显示出了出色的透明度。此外，随着溶胶-凝胶转变的发生，PVA-SbQ在600纳米波长下的透射率从61.2%增加到了85.7%。由于使用了凡士林，侧视图（图2B）稍微有些模糊。在交联后，为了防止水凝胶紧贴培养皿，我们在培养皿上涂了一层少量的凡士林。此外，水凝胶的微观形态在不同尺度上显示出均匀的多孔特性（图2I）。由于高粘度，高浓度的水凝胶（15%）被用于制造器官贴片，这将在后续部分详细说明。与低浓度水凝胶相比（见支持信息中的图S5），高浓度PVA-SbQ水凝胶的较小孔径表明其机械性能随着浓度的增加而得到改善[46]，[47]。

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图2. (A) PVA-SbQ支撑浴中图案化CNT/Pluronic悬浮液的俯视图。(B) PVA-SbQ支撑浴中图案化CNT/Pluronic悬浮液的侧视图。(C) PVA-SbQ水凝胶中图案化CNT/Pluronic悬浮液的俯视图。(D) PVA-SbQ水凝胶中图案化CNT/Pluronic悬浮液的侧视图。(E) 变形前的打印器官贴片。(F) 变形后的打印器官贴片。(G) 其他形状的器官贴片。(H) 15% PVA-SbQ支撑浴和水凝胶的透明度。(I) 不同尺度下交联PVA-SbQ水凝胶的形态。

2.3. 墨水要求
水凝胶的顺利打印得益于巧妙的设计以及选用的符合设计要求的材料。用于在水凝胶中打印导电图案的材料是CNT和Pluronic。CNT不能以粉末形式直接打印，必须将其掺入高粘度的可打印聚合物中。然而，实现CNT在这些聚合物中的均匀分散一直是一个挑战。因此，在本实验中使用了Pluronic与CNT混合。在低温下，Pluronic呈现为粘度非常低的液体[48]，[49]，[50]。因此，当将粉末状的CNT加入冰中的Pluronic时，它们可以很好地分散。借助低温超声波处理，CNT的分散效果可以进一步提高。经过超声波处理后，Pluronic在室温下变成了高粘度的凝胶，确保了CNT的均匀分布。因此，高粘度和均匀的CNT/Pluronic混合物使得通过针头挤出非常稳定的纤维成为可能（图3A）。如果CNT直接分布在用于挤出的高粘度墨水中，即使有超声波的帮助，高浓度的墨水也会阻碍CNT的分布，从而导致打印不连续（图3B）。在考虑使用Pluronic之前，曾尝试使用纤维素和明胶来混合纳米管，但难以实现均匀分散。除了材料的选择外，浓度也对打印性能至关重要。根据相关文献，Pluronic在10-40%的浓度范围内是可打印的[51]，[52]，[53]，[54]。在本研究中，选择了35%的Pluronic以获得更好的分辨率。当CNT与Pluronic的比例低于5%时，仍然可以打印（图3D）。然而，较低浓度的CNT表现出较差的电导率。因此，选择了5%的CNT。对于支撑浴，PVA-SbQ的浓度低于10%时粘度较低，无法充分支撑打印的导电墨水，而15%是最大浓度（图3E）。更高浓度的PVA-SbQ改善了水凝胶的性能，因此选择了15%的PVA-SbQ作为支撑浴。如图3F所示，当4°C下35%浓度的液态Pluronic升至室温时，在15分钟内转变成了凝胶（图3G）。这一特性确保了CNT的均匀分布。加入5%的CNT后，混合物在室温下保持固态，适合挤出打印（图3H）。如图3I所示，打印出的导电CNT/Pluronic纤维是连续且稳定的。评估了最小的可打印直径，并选择了能够成功挤出的最小针头。随着挤出压力的增加（50、70和90 psi），所得纤维的直径分别略微增加到约95、167和368微米，同时保持了良好的分辨率（图3J）。虽然可以实现超细纤维，但它们不利于电性能，并且在拉伸时容易导致导电图案的不连续性。因此，在这个项目中不考虑超细打印，而是使用了直径较大的纤维以确保足够的电导率。在挤出导电CNT/Pluronic纤维后，支撑浴还必须经历溶胶-凝胶转变，以有效地封装打印出的导电图案。与需要调整某些打印参数的导电墨水不同，PVA-SbQ在光照下会迅速且容易地发生溶胶-凝胶转变（图3K和L）。PVA-SbQ的交联导致水凝胶内导电图案的直径发生了微妙的变化（见支持信息中的图S6）。为了更好地观察交联对尺寸的影响，使用了较大的纤维直径。

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图3. (A) 导电CNT/Pluronic墨水的制备。(B) 其他类型导电CNT基墨水的制备。(C) 不同浓度Pluronic的可打印性。(D) 不同浓度CNT的可打印性。(E) 不同浓度PVA-SbQ的可打印性（支撑性）。(F) 4℃下的液态Pluronic。(G) 室温下的固态Pluronic。(H) 室温下的固态CNT/Pluronic。(I) 导电CNT/Pluronic墨水的挤出演示。(J) 不同压力下导电CNT/Pluronic图案的挤出演示。(K) 光交联前的液态PVA-SbQ支撑浴。(L) 光交联后的固态PVA-SbQ水凝胶。(M) 剪切率增加时Pluronic粘度的变化。(N) 剪切率增加时CNT/Pluronic粘度的变化。(O) 剪切率增加时PVA-SbQ粘度的变化。(P) 交联时间增加时PVA-SbQ储能模量（G′）的变化。(Q) 交联时间增加时PVA-SbQ损耗模量（G″）的变化。(R) 交联时间增加时PVA-SbQ粘度的变化。

出色的打印性能主要归功于Pluronic的剪切稀化特性。当受到剪切力作用时，Pluronic的粘度降低，使其能够顺利通过针头并根据针头的移动形成特定的图案（图3M）。加入CNT后，Pluronic的粘度增加（图3N）。因此，当CNT浓度超过5%时，过高的粘度需要更大的压力来进行墨水挤出，使得打印变得困难。尽管如此，5%的CNT仍然表现出良好的剪切稀化特性（图3N）。此外，支撑浴也表现出剪切稀化特性，促进了其在介质中的无缝移动（图3O）。除了适当的粘度和剪切稀化特性外，支撑浴还必须具备良好的光交联特性，以促进水凝胶贴片的形成。实时监测水凝胶的交联过程对于理解PVA-SbQ在交联过程中的动力学至关重要。这种监测包括记录PVA-SbQ水凝胶的储能模量（G'）、损耗模量（G'')和粘度随时间的变化（图3P、Q、R）。这些模量表明了PVA-SbQ水凝胶在施加应力下储存和释放能量的能力。最初，由于水凝胶前体溶液缺乏明确的网络结构，储能模量和粘度都相对较低。然而，随着交联的进行，这些参数通常会增加，表明水凝胶内部形成了更坚固的网络（图3P、R）。同时，损耗模量也最初增加，因为前体溶液由于交联反应而发生了粘度变化。随着交联反应的继续，储能模量进一步上升，最终在网络结构完全形成时达到一个平台值。此时，水凝胶被认为已经完全交联，其机械性能稳定下来。与此同时，损耗模量开始下降，直到达到一个平台值，标志着水凝胶从粘性行为转变为弹性行为（图3Q）。导电CNT/Pluronic墨水的挤出性能和均匀分散，加上PVA-SbQ支撑浴的交联和支持特性，保证了器官贴片的成功制造。

2.4. 机械性能
PVA-SbQ水凝胶的机械性能在确保这些贴片的有效性方面发挥了关键作用。如图4A、B、C所示，PVA-SbQ水凝胶在封装CNT时表现出显著的机械性能。这些水凝胶表现出卓越的韧性，能够承受接近180度的折叠（图4A）、扭转（图4B）和拉伸（图4C），同时保持水凝胶基质和嵌入的导电纤维的完整性。未经PVA-SbQ水凝胶封装的导电CNT/Pluronic图案在受力时容易断裂。水凝胶的封装为打印出的导电图案提供了灵活性，这对于各种应用至关重要，特别是在制造器官贴片时。水凝胶的强机械强度赋予了器官贴片在使用过程中广泛的力承受范围。此外，水凝胶的断裂伸长率显著影响了内部导电图案的变形。水凝胶中的较高应变对应于内部图案的更明显变化，从而扩展了检测范围（图4D）[55]，[56]，[57]。详细的机械分析显示，封装在水凝胶中的导电纤维的最大抗拉强度为0.7 MPa，断裂伸长率为67%，在90%压缩变形下的抗压强度为15.63 MPa（图4E和F）。此外，水凝胶的保水能力对其操作寿命至关重要[58]，[59]。由于水凝胶中含有丰富的羟基，它们表现出强烈的保水亲和力，导致水分损失速率相对较慢。这一特性有助于水凝胶的长期实用性，因为它确保了长时间的水分保持和功能（图4G）。

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图4. (A) 器官贴片的弯曲。(B) 器官贴片的扭转。(C) 器官贴片的拉伸。(D) 水凝胶封装的重要性。(E) 器官贴片的拉伸应力-应变曲线。(F) 器官贴片的拉伸应力-应变曲线。(G) 随时间增加的器官贴片水分损失率曲线。

2.5. 粘附性能
近年来，开发出强粘附性的水凝胶引起了广泛关注[60]，[61]，[62]。除了出色的机械性能外，PVA-SbQ水凝胶作为心脏贴片还具有显著的优点，因为它们具有很强的粘附性。PVA-SbQ上的自由羟基有助于粘附性能[63]。PVA-SbQ水凝胶与基底之间的粘附力源于PVA-SbQ链上的羟基与基底表面上的羧基、氨基或羟基之间的氢键相互作用。如图5A所示，水凝胶能够粘附到小鼠的各种组织和器官上，如心脏、肌肉、胃、脾脏、脂肪和肾脏，表明其在不同生物环境中的强粘附性能。然而，由于人体器官的不规则性，使用拉伸机夹具难以准确测量水凝胶在不同器官上的粘附力[64]。因此，本手稿中没有包括PVA-SbQ水凝胶与器官之间的具体粘附值。除了生物组织外，PVA-SbQ水凝胶还表现出对各种常见材料的粘附性。已经量化了水凝胶在不同基底上的粘附强度，分别在纸张、玻璃、橡胶、塑料、金属、木材和猪皮上的粘附强度为36、34、26、26、26、19和26 kPa（图5B）。与之前的研究相比，水凝胶浓度的增加提高了粘附强度（从8%增加到15%）[44]。总之，强粘附性和优异的机械性能的结合使得PVA-SbQ水凝胶特别适合用于生物医学应用，尤其是涉及与器官粘附的应用，如器官贴片。PVA-SbQ水凝胶通过氢键相互作用与各种基底形成强键的能力确保了它们在复杂生理环境中的功能性和耐用性（图）。S7，支持信息）。下载：下载高分辨率图像（175KB）下载：下载全尺寸图像

图5. (A) PVA-SbQ水凝胶与不同小鼠器官和组织之间的粘附（从左到右，从上到下，所示的器官和组织分别是心脏、肌肉、胃、脾脏、脂肪和肾脏）。(B) PVA-SbQ水凝胶与各种基底之间的粘附强度。

2.6. 电导率
水凝胶被用于器官贴片，以促进生命活动的检测，其中电导率和灵敏度都是必不可少的。如图6A所示，打印的导电纳米管/Pluronic纤维表现出优异的电导率，足以点亮灯泡。用于外部封装的水凝胶本身是不导电的。因此，通过在水凝胶基质中加入导电纤维来实现电导率。将纳米管整合到水凝胶中显著提高了器官贴片的整体电导率。图6B表明，当纳米管含量达到5%时，电导率达到了0.26 S/m。虽然预计进一步增加纳米管含量会提高电导率，但超过5%的浓度会对打印性能产生不利影响。这是由于粘度增加和流变性质改变，使得在水凝胶中创建导电纤维的平滑挤出和精确图案化变得复杂。必须在最大化电导率和保持水凝胶的可打印性之间找到平衡，以确保这些先进生物医学设备的实际可行性。内部的导电图案为器官贴片提供了电导率，而用于封装的水凝胶则提供了灵活性，使器官贴片具有可伸展性。在拉伸过程中，导电图案的长度和直径的变化会改变其电导率，进而影响灯泡的亮度（当水凝胶作为导线时）（图6C）。这一特性使水凝胶能够在外部刺激下产生独特的电化学信号。在没有变形的情况下，电阻保持不变（图S8，支持信息）。当水凝胶被压缩或拉伸时，其电阻相应改变，从而产生相应的电信号（图6D和E）。植入体内后，水凝胶会粘附在器官表面，例如肺部。随着肺部在呼吸时的膨胀和收缩，水凝胶也会相应变形，产生反映器官活动的电信号（图6F）。使用真实的肺部活动来验证器官贴片的电导率和灵敏度面临重大挑战。为了解决这个问题，制造了一个中空的柔软材料，并将其连接到空气泵上，通过调节空气的吸入和排出来模拟人类的呼吸（图6G和视频S2，支持信息）。我们的发现表明，在长时间缓慢呼吸（正常呼吸状态）下，电阻变化的范围较小，频率较低（图6H）。相反，在快速呼吸（呼吸急促）时，电阻变化的范围和频率增加（图6H）。这种信号变化类似于心电图，表明水凝胶贴片有可能被植入人体，以检测内部器官的微妙活动以及其他电导信号，为脑机接口、细胞活动监测和更广泛的生理调节提供潜在应用。

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图6. (A) CNT/Pluronic纤维、PVA-SbQ水凝胶以及封装有CNT/Pluronic纤维的PVA-SbQ水凝胶，用于点亮LED灯。(B) PVA-SbQ水凝胶以及封装有1%、3%、5% CNT的PVA-SbQ水凝胶的电导率。(C) 拉伸时LED灯亮度的变化。(D) 轻微触碰引起的相对电阻变化。(E) 拉伸引起的相对电阻变化。(F) 呼吸引起的器官贴片在肺部的变形。(G) 用作简单人工肺的中空柔软材料。(H) 缓慢呼吸引起的相对电阻变化。(I) 快速呼吸引起的相对电阻变化。

2.7. 细胞培养
除了其粘附性、柔韧性和电导率外，封装有CNT/Pluronic图案的PVA-SbQ水凝胶还因其图1中所示的独特打印方法而被用作器官贴片。这种方法使PVA-SbQ水凝胶能够封装导电材料，防止CNT直接接触人体。因此，器官贴片保持生物相容性，确保安全有效地整合到体内。为了评估打印器官贴片在生物医学应用中的适用性，我们检查了这些水凝胶的细胞相容性。本研究使用NIH 3T3小鼠成纤维细胞作为模型细胞，并在打印器官贴片的表面进行培养。这种设置模拟了皮肤或组织与植入的PVA-SbQ生物医学设备表面的接触情况。代表性图像（图7A）展示了几天培养过程中细胞生长的进展。细胞逐渐从圆形点变为细长形状，从第0天到第3天细胞数量明显增加。NIH 3T3小鼠成纤维细胞的细长和纺锤形形态表明它们在兼容的微环境中的自然状态。由于成纤维细胞是粘附性细胞类型，它们对基底的粘附对于生存和增殖至关重要。观察到的细胞细长纺锤形形态突显了它们对水凝胶表面的粘附，表明PVA-SbQ水凝胶为细胞生长提供了合适的生物相容性基底。在10倍放大镜下观察到的细胞，数量（图7B）、体积（图7C）和长度（图7D）随时间逐渐增加，表明心脏贴片的生物相容性及其在生物医学应用中安全有效使用的潜力。

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图7. (A) 3天培养过程中器官贴片上荧光NIH/3T3细胞的共聚焦激光扫描显微镜显微照片（物镜放大倍数分别为4×和10×，用于不同的比例）。(B) 随时间增加的细胞数量变化。(C) 随时间增加的细胞面积（灰度值）变化。(D) 随时间增加的细胞长度变化。

3. 结论
总之，使用FRESH启发的封装方法将导电材料整合到水凝胶基质中，为生物医学技术带来了重大进展。通过将图案化的导电材料封装在水凝胶中，这种方法在保持生物相容性的同时提高了功能性。所得到的水凝胶复合材料表现出电导率、柔韧性和粘附性，使其适用于器官贴片等应用。水凝胶复合材料的机械性能、粘附强度和电导率已经得到了彻底表征，证明了它们在生物医学应用中的适用性。此外，细胞相容性研究证实了这些器官贴片的生物相容性，进一步支持了它们在生物医学植入物中的潜在用途。虽然单独考虑时水凝胶复合材料的个别性能并不突出，但在单一水凝胶系统中整合电导率、柔韧性、粘附性和生物相容性，创造了一种非常适合体内应用（如器官贴片）的材料。通过仔细的材料选择和有目的的打印设计，这种综合性能的结合突显了这种方法在构建多功能水凝胶用于生物医学植入方面的有效性。总体而言，这项研究为开发具有增强功能和生物相容性的新型器官贴片奠定了基础。除了器官贴片之外，这种打印方法和水凝胶的优异性能还可以应用于各种与器官直接接触的体内应用，包括神经接口、细胞活动调节平台和其他可植入的生物医学设备。

4. 实验方法
4.1. 材料
含有苯乙烯吡啶基团的聚乙烯醇（PVA-SbQ，10克PVA-SbQ聚合物含有4.1%摩尔SbQ）从Polysciences（美国）购买。Pluronic F-127（12600克/摩尔）从MilliporeSigma（加拿大安大略省奥克维尔）获得。多壁碳纳米管（CNT，外径<20纳米）从Cheap Tubes Inc（美国佛蒙特州）获得。购买的CNTs外径为13–18纳米，长度为3–30微米，纯度为99%（重量），比表面积大于233平方米/克，ζ电位在-5至-10毫伏范围内。

4.2. 器官贴片的制备
为了制备和打印器官贴片，首先将Pluronic粉末与去离子水按重量比35%混合。由于Pluronic粉末在室温下不溶解，因此将混合物放入4°C的冰箱中24小时直至完全溶解。冷藏后，将溶液转移到冰桶中以保持低温。接下来，按重量比5%向溶解的溶液中加入CNT，并充分搅拌，然后在低温下进行30分钟的超声处理以确保均匀分散。将得到的溶液倒入注射器中，静置30分钟使其变成溶胶。同时，准备15%的PVA-SbQ溶液并装入打印容器中作为支撑浴。随后，将装有溶胶的注射器安装到3D打印机中，并调整针头位置使其位于PVA-SbQ溶液的中心。使用G代码打印所需的图案，并将其悬挂在支撑浴中。然后将容器移动到投影仪下固化3分钟以固化结构。最后，小心地从容器中取出固化的水凝胶以获得器官贴片。打印精度由喷嘴直径、挤出压力和打印速度的协调优化决定。较小的喷嘴直径需要较高的挤出压力，而打印速度对图案的准确性至关重要，过低的速度会导致材料堆积，过高的速度会导致不连续的纤维。因此，这些参数需要共同调整以确保稳定的挤出和精确的图案化。然而，由于Pluronic是一种热响应性水凝胶，其粘度高度依赖于温度和湿度，因此最佳打印参数需要根据具体的打印温度进行调整。

4.3. 紫外-可见光透射率测试
使用紫外-可见光分光光度计（Shimadzu UV-160 A，日本）评估了15% PVA-SbQ水凝胶和15% PVA-SbQ前体溶液的透射率。在前体溶液和水凝胶的透射率测量中，波长范围为200至800纳米。

4.4. 扫描电子显微镜分析
使用Hitachi S4800扫描电子显微镜（日本东京）观察PVA-SbQ水凝胶的形态。水凝胶样品先经冷冻干燥，然后在液氮中破裂。之后，在水凝胶的破裂表面喷涂一层薄金，并在5千伏下观察以获得高质量的图像。

4.5. 流变特性表征
所有流变特性测试均使用配备Peltier板的MCR 302e流变仪（Anton Paar，奥地利）进行。所有实验均使用直径为25毫米、间隙距离为0.5毫米的不锈钢平行板，在室温下进行。剪切速率扫描用于监测Pluronic和CNT/Pluronic在0.01–1000 1/s范围内的剪切变稀行为和粘度变化，而PVA-SbQ支撑浴的剪切速率范围为0.01–100 1/s，因为其原始粘度较低。为了评估光交联动力学，底板被替换为透明表面，以便在交联过程中进行光照。在记录光交联动力学时，从下方向样品照射可见光以启动交联。实验开始后一分钟，继续向样品照射可见光，持续5分钟。在恒定剪切速率1%和角频率1赫兹的振荡模式下监测凝胶在光固化过程中的流变性能变化。同时记录了光交联生物墨水的储能模量和损耗模量以及粘度。

4.6. 机械性能测试
通过在Instron 5967电子万能试验机上进行拉伸测试来评估器官贴片的拉伸强度。器官贴片被切割成哑铃形样品，直径为7–9毫米，厚度为3–5毫米，长度为15–30毫米。此外，还在Instron 5967电子万能试验机上对直径为5–15毫米、厚度为3–6毫米的圆柱形水凝胶样品进行压缩测试，室温下进行。压缩速率为2毫米/分钟。每个样品的测量至少重复三次，所得数据报告为平均值和标准偏差。

4.7. 失水率测试
封装有CNT/Pluronic图案的PVA-SbQ水凝胶被放置在装有去离子水的烧杯中48小时，直到达到膨胀平衡。在特定时间间隔记录样品的重量。水分流失率可以通过以下公式计算：(1)水分流失百分比 = (Ws - Wt) / Ws × 100，其中Ws是膨胀水凝胶的重量，Wt是时间t时干燥培养皿中无水水凝胶的重量。4.8. 电学测试使用电化学工作站（CHI 660e，CH Instruments, Inc.，美国）通过线性扫描伏安法测量了纯PVA-SbQ水凝胶和器官贴片的电导率。水凝胶的电导率（σ）由公式(2)给出：(2)σ = l / RS，其中l是长度（毫米），S是横截面积（毫米2），R是电化学工作站测得的电阻值。在计算心脏贴片的电导率时，考虑的是封装导电图案的长度和横截面积，而不是水凝胶本身的。器官贴片的相对电阻变化也是在使用0.5伏特恒定电压的情况下，通过电化学工作站检测不同变形情况下的变化得出的。电阻的相对变化由公式(3)给出：(3)ΔR/R0 = (R - R0) / R0 × 100%，其中R0是0%应变时的原始电阻（欧姆），R是在特定应变下的实时电阻。4.9. 黏合强度测试为了评估水凝胶的粘合性能，进行了剪切粘合强度测试。将PVA-SbQ水凝胶裁剪成40.0 × 10.0 × 2.0毫米的尺寸，两个PET膜（塑料）也裁剪成40.0 × 10.0毫米的尺寸作为粘合剂。接下来，将两个PET膜粘贴在水凝胶样品上。然后，使用压力机对样品进行5分钟的压紧。最后，在固定一个PET膜的同时，以20毫米/分钟的速度移动另一个PET膜，并记录力响应。实验中每组测试3个样品以获得平均值和标准偏差。粘合强度通过最大载荷除以粘合面积来计算。水凝胶与其他基底之间的粘合力也使用相同的方法进行测试，但水凝胶的接触面积会根据基底的大小和形状略有不同。“4.10. 细胞培养荧光3T3成纤维细胞系在装有细胞培养基的玻璃细胞培养板中培养，并在37°C和5% CO2的条件下孵育。细胞培养基由Dulbecco改良的Eagle培养基（Lonza，巴塞尔，瑞士）组成，添加了10%（体积比）热灭活的胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州）和1%（体积比）青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich）。首先，在35毫米的培养皿中制备器官贴片，形成5毫米厚的圆盘，并用PBS清洗三次以去除未交联的前体溶液。接下来，使用胰蛋白酶从组织培养板上分离出培养的细胞，然后以1500转/分钟的速度离心3分钟。收集到的细胞沉淀物重新悬浮在细胞培养基中并分配到圆盘上。细胞接种密度保持在0.2 × 10^6个细胞/培养皿。向培养皿中添加额外的细胞培养基（1500微升），并在37°C和5% CO2的条件下培养样品。每天使用荧光显微镜在FITC通道下观察细胞生长情况。通过ImageJ处理荧光图像来量化细胞数量、面积和长度。其中，细胞面积由灰度值表示。平均灰度值是所有像素值的总和除以像素数量。伦理声明本文不包含任何作者进行的涉及人类或动物的研究。与呼吸相关的实验使用了3D打印的器官模型作为体外模拟器，而不是活体人体组织。用于粘合测试的小鼠器官是从另一个实验室因无关程序而安乐死的动物身上获得的废弃生物材料。本研究中没有处理活体动物，也没有进行额外的动物实验。CRedI作者贡献声明张康：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理、概念化。沈晨宇：撰写——审阅与编辑、软件。申在荣：软件、方法学。Kartikeya Dixit：软件、方法学。Hitendra Kumar：方法学。张宏光：方法学、数据管理。刘大晨：撰写——审阅与编辑。卢庆业：资源准备。陈刚：资源准备。李贤宰：撰写——审阅与编辑、资源准备、方法学。金圭英：撰写——审阅与编辑、监督、资源准备。胡金光：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。