《Materials Today Bio》：Immunomodulatory and dentinogenic potential of surface-engineered hesperetin-functionalized composite scaffolds for pulp-dentin regeneration
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为攻克龋损牙齿在炎症环境中维持牙髓活力并促进牙本质再生的难题，本研究构建了一种经表面改性（碱水解）并负载黄酮类化合物橙皮素（HT）的聚己内酯/纳米羟基磷灰石（PCL/nHA）纳米纤维支架。该平台能持续释放HT与钙离子，显著促进了人牙髓细胞的迁移、增殖、成牙本质分化及矿化基质形成；在炎症微环境中有效下调促炎因子、上调促消退介质，并调控巨噬细胞向M2型极化。体内皮下植入实验进一步证实其良好的生物相容性、减轻炎症浸润及促进早期修复反应的能力。这项工作为设计兼具免疫调节与成牙信号引导功能的下一代牙髓治疗生物材料提供了新策略。
当牙齿因深度龋坏导致牙髓暴露，如何保存这颗牙齿的“生命”——即牙髓活性，并诱导其再生出新的牙本质屏障，是牙科医生面临的一大挑战。传统用于盖髓（直接覆盖在暴露牙髓上）的材料，如氢氧化钙或矿物三氧化聚合体（MTA），主要通过释放高浓度氢氧根离子（OH-）形成强碱性环境来杀菌和促进矿化。然而，这种“强效”手段有时会矫枉过正：过度的碱性刺激可能加剧局部氧化应激和炎症反应，甚至导致牙髓表层坏死，反而为细菌再感染和炎症迁延埋下隐患。尤其在已经存在炎症的牙髓环境中，如何精准地“安抚”而非“镇压”免疫系统，同时有效“唤醒”牙髓自身的干细胞进行修复，成为实现成功再生的关键。近年来，源自天然植物的黄酮类化合物因其多效的生物活性（如抗炎、抗氧化、促矿化）而备受关注。其中，橙皮素（hesperetin， HT）表现尤为突出，它在低浓度（10-15 μM）下即能有效调节炎症并促进生物矿化。但如何将这种疏水性的分子稳定、可控地递送至牙髓损伤部位，并协同支架材料的物理化学特性共同指导细胞行为，仍是一个待解的难题。
为此，由Igor Paulino Mendes Soares、Caroline Anselmi、Marco C. Bottino等来自巴西圣保罗州立大学（UNESP）口腔医学院的研究团队，在《Materials Today Bio》上发表了一项创新性研究。他们设计并开发了一种集表面工程与药物控释于一体的多功能纳米纤维支架，旨在为炎性环境下的牙髓-牙本质界面再生提供一个“生物指令性”平台。该支架以聚己内酯（PCL）和纳米羟基磷灰石（nHA）复合纳米纤维为基础，首先通过温和的碱水解（H-）处理其表面，显著提高了材料的亲水性；随后，将橙皮素（HT）吸附到纤维上，构建了能够持续释放生物活性分子的功能化支架（H-PCL/nHA+HT）。
本研究综合运用了多项关键技术方法。首先，通过静电纺丝技术制备PCL/nHA复合纳米纤维支架，并进行碱水解和HT吸附的表面功能化。利用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、水接触角测量等进行系统的物理化学表征。在生物学评价方面，使用了人牙髓细胞（hDPCs）进行迁移、增殖、成牙本质基因（如 DSPP, DMP1）和蛋白表达以及矿化能力（茜素红染色）的检测。为模拟炎症环境，研究采用了脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞模型评估免疫调节效果，并建立了一个创新的三维（3D）体外模拟盖髓模型，该模型包含牙本质片、人工髓室和包裹在胶原基质中的hDPCs，以更真实地复现临床炎症盖髓场景。最后，通过大鼠皮下植入实验评估了材料的体内生物相容性、宿主整合及免疫反应（通过免疫荧光标记iNOS和CD163分析巨噬细胞M1/M2极化）。
研究结果
3.1. 支架的形态与物理化学表征
扫描电镜显示所有组别的支架均具有随机取向的纤维结构，碱水解使纤维平均直径从约600 nm减小至约400 nm，但未破坏纤维完整性。FTIR光谱证实了PCL、nHA和HT的特征峰，碱水解后羟基（-OH）伸缩振动带增强，表明表面亲水性基团增加。水接触角测量直接证明碱水解使支架从疏水性（~129°）转变为亲水性（H-PCL/nHA+HT组低至~16°）。HT吸附效率在碱水解后显著提高（从~20%升至~36%）。释放动力学表明HT的释放是扩散控释机制，在168小时（7天）内完成累积释放。此外，支架能持续释放钙离子（Ca2+）超过49天，且pH值保持在中性范围，材料在120天内降解缓慢，质量保持率超过95%。
3.2. 牙髓细胞迁移与纤连蛋白表达
Transwell迁移实验表明，H-PCL/nHA+HT支架释放的生物活性成分（HT和Ca2+）能最有效地诱导hDPCs迁移。同时，该组细胞展现出更大的肌动蛋白铺展面积和更高的纤连蛋白（Fibronectin）表达量及纤连蛋白/肌动蛋白比值，表明迁移的细胞具有更强的粘附和基质合成能力。
3.3. 支架与牙髓细胞的直接相互作用
所有支架均支持hDPCs的粘附、增殖和存活。与对照组（PCL/nHA）相比，H-PCL/nHA+HT在第7天表现出更高的细胞代谢活性。培养14天后，HT吸附和/或碱水解处理上调了成牙本质标志基因 ALPL 和 DSPP 的表达，而H-PCL/nHA+HT是唯一能显著上调 DMP1 基因的组别。蛋白水平上，H-PCL/nHA+HT组的DSPP阳性区域面积显著高于对照组。培养21天后，碱水解处理（无论是否含HT）均增强了矿化基质的形成，H-PCL/nHA+HT组的茜素红染色强度约为对照组的1.7倍，同时细胞内的可溶性钙含量降低，证实了钙被有效地摄取并沉积到矿化基质中。
3.4. 支架与炎症细胞的间接相互作用
使用LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞模型评估支架提取物的免疫调节作用。虽然3小时基因表达变化不显著，但24小时后，含HT的支架提取物能显著降低巨噬细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和亚硝酸盐（反映一氧化氮产生）的水平，表明HT能有效抑制促炎介质的分泌。
3.5. 炎症微环境下的体外盖髓模型
在模拟临床盖髓场景的3D炎症模型中，H-PCL/nHA+HT支架在接触3小时后，即能显著下调LPS预刺激的hDPCs中 IL8、IL6、IL1B、TNF、MMP9 等促炎基因的表达，并上调抗炎基因 IL10。培养14天后，该支架显著上调了成牙本质/再生相关基因 COL1A1、ALPL、DSPP、OPN（骨桥蛋白）和 OCN（骨钙素）的表达。
3.6. 体内皮下生物相容性、免疫调节与矿化潜能
在大鼠皮下植入实验中，H-PCL/nHA+HT支架表现出良好的组织整合性。与PCL/nHA对照组相比，H-PCL/nHA+HT在植入1周和8周时引发了更少的炎症细胞浸润。更重要的是，免疫荧光分析显示，在植入1周时，H-PCL/nHA+HT组诱导了更低的M1型巨噬细胞标志物iNOS阳性面积和更高的M2型标志物CD163阳性面积，表明其能早期促进巨噬细胞向促修复的M2表型极化。到第4周，两组的炎症反应趋于一致。组织学观察发现H-PCL/nHA+HT组周围的纤维囊更薄、更有序。然而，在8周时，皮下植入部位未检测到成骨/成牙标志蛋白骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（OCN），表明在该异位模型中未形成矿化组织。
结论与讨论
本研究成功地开发并验证了一种表面工程化的橙皮素功能化PCL/nHA复合纳米纤维支架。该支架通过碱水解实现的表面改性，不仅大幅提升了亲水性，还增强了HT的吸附与可控释放，并能长期提供钙离子。这种物理化学特性的协同作用，在体外创造了一个有利于牙髓细胞招募、增殖和向成牙本质细胞分化的微环境。尤为关键的是，该平台展现出强大的免疫调节能力：在炎症模型中，它能有效“安抚”过度活跃的免疫反应，下调关键促炎因子，同时上调促成牙本质生成的基因，实现了从“炎症消退”到“再生启动”的巧妙衔接。
体内皮下实验进一步证实了其良好的生物相容性和主动调节宿主免疫反应的能力，表现为早期引导巨噬细胞向促修复的M2表型极化，并减轻慢性炎症反应。虽然异位模型未能证明其成骨/成牙潜力，但这主要反映了模型本身的局限性，而非材料的固有缺陷。该研究最重要的意义在于，它超越了传统盖髓材料仅关注细胞相容性或强碱性刺激的思路，提出了一种“免疫调节-再生信号整合”的新策略。通过将表面工程与天然生物活性分子的控释相结合，该支架能够时空协调地调控牙髓损伤部位的免疫微环境和干细胞行为，为开发下一代用于牙髓活力保存治疗（Vital Pulp Therapy, VPT）的“免疫知情型”生物材料提供了重要的概念框架和实验依据。未来研究需要在更贴近临床的牙髓原位模型中验证其促进牙本质桥形成的能力，并评估其与现有临床材料的对比优势。
