《Metabolism》：Folic acid mitigation of alcohol-induced sarcopenia via gut-muscle axis modulation
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本研究通过动物实验和体外模型，揭示叶酸（FA）通过调节肠-肌肉轴缓解酒精性肌萎缩的机制。结果显示，FA显著改善酒精诱导的肌肉质量、力量及线粒体功能（P<0.05），抑制肌肉萎缩相关信号通路（MSTN）的表达，并纠正肠道菌群失衡（如IS代谢物升高）。移植高剂量FA处理小鼠的肠道菌群可复制FA的肌肉保护效应，证实肠道菌群是FA发挥疗效的关键介质。FA通过改善Hcy代谢轴、抑制MSTN介导的蛋白降解及调节菌群-代谢网络协同恢复肌肉稳态。
张楠|史静|张华琪|周志通|刘曼|梁曦|周一帆|张克宁|崔子谦|薛梅兰|梁慧
青岛医学院，青岛大学，中国青岛，266071
摘要
背景
与酒精相关的肌肉功能障碍非常普遍，严重影响了酒精使用障碍患者的生活质量。长期饮酒导致的叶酸（FA）缺乏可能会加重与酒精相关的疾病，但有研究表明叶酸对肌肉健康具有保护作用。然而，叶酸通过肠道-肌肉轴保护骨骼肌的具体机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨叶酸是否能够预防酒精引起的肌肉萎缩，并阐明肠道-肌肉轴的潜在机制。
方法
在体内实验中，8周大的雄性C57BL/6J小鼠被给予Lieber-DeCarli酒精饮食12周，并分别给予叶酸（2.5或5 mg/kg）或伊德贝酮（2.5 mg/kg）。为了进一步研究肠道-肌肉轴的作用，我们进行了肌抑素（MSTN）调控和粪便微生物群移植（FMT）实验。评估指标包括肌肉质量和力量、组织学、线粒体功能、氧化应激和炎症标志物、肠道微生物群以及血清代谢组学。在体外实验中，C2C12肌母细胞被乙醇或吲哚硫酸盐（IS）处理后补充叶酸，以研究其作用机制。
结果
叶酸干预有效恢复了肌肉质量和力量，降低了同型半胱氨酸水平，并改善了线粒体功能（P < 0.05）。从机制上看，叶酸下调了MSTN信号通路，减少了蛋白质降解并增加了蛋白质合成（P < 0.05）。体内功能获得和丧失实验证实了MSTN在叶酸保护作用中的关键中介作用。综合多组学分析表明，叶酸重新平衡了肠道微生物群-代谢物网络，其中吲哚硫酸盐被确定为关键的肠道来源的调节因子。来自高剂量叶酸处理供体的FMT实验复制了肌肉保护效果，证实了肠道微生物群在叶酸治疗效果中的关键作用。体外实验中，40 μM的叶酸改善了线粒体膜电位并增加了肌管融合指数，同时抑制了MSTN通路的激活（P < 0.05）。
结论
叶酸通过调节肠道-肌肉轴显著减轻了酒精性肌肉萎缩。具体而言，叶酸纠正了酒精-同型半胱氨酸轴的失调，增强了线粒体功能。此外，叶酸还重新平衡了肠道微生物群-代谢物网络，并抑制了MSTN介导的过度蛋白质降解，从而整体恢复了肌肉蛋白质的稳态。
引言
肌肉萎缩表现为与年龄相关的骨骼肌质量、力量和身体表现下降[1]。临床和动物研究表明，酒精会破坏骨骼肌功能和代谢，影响蛋白质稳态，并导致II型肌纤维萎缩，最终引发肌肉萎缩[2],[3],[4]。酒精性肌肉萎缩增加了跌倒、骨折、代谢综合征和心血管事件的风险，并加剧了肝病和认知障碍的进展，影响了40-60%的酗酒者[5]。因此，阐明酒精引起的骨骼肌丢失机制并开发安全有效的营养干预措施是老年医学和运动代谢领域的重要任务。
酒精性肌肉萎缩是由氧化应激、炎症和线粒体功能障碍组成的病理循环引起的。酒精引起的氧化应激会损害线粒体完整性，增加活性氧（ROS）和促炎介质。长期乙醇暴露会通过干扰蛋氨酸循环耗尽叶酸并升高血浆同型半胱氨酸（Hcy）水平[6]。高同型半胱氨酸血症会刺激ROS生成，损害线粒体功能，并减少骨骼肌中的ATP合成，同时上调促炎细胞因子[7]。升高的TNF-α会激活肌肉特异性环指蛋白1（MuRF1），影响关键的肌生成调节因子如重组肌生成分化因子（MyoD）和肌生成蛋白（MyoG）[8]。这一级联反应破坏了肌肉蛋白质合成的平衡，阻碍了肌肉再生。
来自肠道-肌肉轴的新证据强调了肠道微生物群及其代谢物对骨骼肌生理和肌肉萎缩发病机制的调节作用[9]。长期饮酒会扰乱肠道微生物群稳态并削弱肠道屏障完整性。包括脂多糖（LPS）和吲哚硫酸盐（IS）在内的微生物代谢物会显著调节骨骼肌干细胞的稳态[10]。最近的研究发现，循环中的IS水平与MSTN和肌肉萎缩F-box蛋白（MAFbx/Atrogin-1）的表达呈正相关[11]。MSTN属于转化生长因子β（TGF-β）超家族，是骨骼肌生长的主要抑制因子。研究表明，抑制MSTN活性可使小鼠肌肉质量增加10%，表明阻断MSTN或其受体可能增强肌肉质量（参考文献S1）。IS暴露会诱导MSTN表达，触发Smad2/3介导的转录级联反应[12]。这些因子与FOXO转录因子相互作用，调控肌肉E3泛素连接酶（包括MAFbx和MuRF-1）的表达，从而驱动蛋白酶体依赖的肌肉蛋白质分解[13]。此外，MSTN过表达会抑制AKT/mTOR通路并抑制MyoD、MyoG和MYHC的转录活性，导致肌肉力量和质量的下降。因此，酒精性肌肉萎缩是由多种系统和分子途径的复杂相互作用引起的。
叶酸（FA）参与核酸和神经递质代谢，并催化Hcy向蛋氨酸的转化[14]。老年人血清中的叶酸水平与握力呈正相关，表明叶酸在维持肌肉力量方面发挥作用[15]。动物研究表明，叶酸摄入量减少会导致老年小鼠肌肉纤维横截面积减少16%，表明叶酸缺乏会随着年龄增长而损害肌肉功能（参考文献S2）。此外，低叶酸水平和升高的Hcy水平分别与肌肉功能下降相关[7]。因此，叶酸缺乏与肌肉力量下降、功能障碍和肌肉萎缩风险增加有关，这可能是由于Hcy代谢紊乱、线粒体功能障碍和细胞凋亡引起的。我们之前的研究表明，叶酸补充（5 mg/kg）可以缓解酒精引起的肝脏损伤，减少肝脏组织中的Hcy诱导的氧化损伤，并增强线粒体活性[16]。许多研究指出，叶酸的剂量通常在400 μg/kg到10 mg/kg之间，没有明显异常[17],[18]。同时，叶酸可以改善酒精暴露小鼠的肠道环境，恢复微生物平衡，增强肠道屏障功能，并增加短链脂肪酸（SCFA）的产生[19]。这些发现表明叶酸具有预防酒精性肌肉萎缩的营养干预潜力。
本研究旨在通过肠道-肌肉轴阐明叶酸在缓解酒精性肌肉萎缩中的关键作用。具体而言，建立了酒精性肌肉萎缩的小鼠模型，并通过叶酸补充来评估其在体内的保护效果。此外，采用了多方面的方法，包括16S rDNA测序、非靶向代谢组学和C2C12肌母细胞研究，以解析肠道-肌肉轴内的机制途径。
材料
叶酸（Sigma-Aldrich，目录号F7876；纯度≥97%，分子量441.40 Da）和吲哚硫酸盐（Glpbio，目录号GC43903）从指定供应商处购买。Trevogrumab（MedChemExpress，目录号HY-P99388）和Mdivi-1（MedChemExpress，目录号HY-15886）也通过商业渠道获取。含有乙醇的Lieber-DeCarli液体饮食（乙醇浓度4%）及相应的非酒精对照饮食来自Trophic Animal Feed High-tech Co., Ltd。所有其他试剂均为分析级。
动物和实验处理
8周大的雄性C57BL/6J小鼠
叶酸对酒精暴露小鼠肌肉质量、力量和结构的影响
初步实验结果显示，叶酸（5 mg/kg）补充剂增加了野生型小鼠的腓肠肌质量，肌肉纤维排列有序且紧密（图S1）。在12周的酒精实验中，模型组的体重增加明显低于对照组，而伊德贝酮和叶酸干预则改善了体重增加（图1A）。Gas和Sol肌肉质量的定量分析显示……
讨论
酒精作为一种肌毒素，会损害骨骼肌功能和代谢，导致蛋白质稳态失调，最终促进肌肉萎缩[31]。因此，与酒精相关的肌肉损失是一个全球性的公共卫生问题。本研究表明，叶酸通过维持肌肉蛋白质稳态和保护线粒体功能减轻了酒精引起的肌肉损伤。这些有益效果可能与叶酸对肠道微生物群的调节作用有关。
研究的局限性
尽管本研究阐明了叶酸对酒精性肌肉萎缩的保护作用，但仍有一些方面需要进一步研究以验证和扩展这些发现。仅使用雄性小鼠模型有助于建立清晰的初始机制框架，但这种设计排除了研究性别差异的可能性，因此未来需要包含更多性别差异的研究。
结论
总之，本研究首次报告了叶酸通过调节肠道-肌肉轴缓解酒精性肌肉萎缩的作用。具体而言，叶酸纠正了酒精-同型半胱氨酸轴的失调，减少了肌肉中的氧化应激和炎症反应，并增强了线粒体功能。此外，叶酸重新平衡了肠道微生物群-代谢物网络，并抑制了MSTN介导的过度蛋白质降解，从而整体恢复了肌肉蛋白质的稳态。
作者贡献声明
张楠：撰写初稿、数据整理、概念构思。史静：数据整理。张华琪：数据整理。周志通：正式分析。刘曼：正式分析。梁曦：资源支持。周一帆：资源支持。张克宁：概念构思。崔子谦：概念构思。薛梅兰：资金获取。梁慧：监督、项目管理和资金获取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号82273626）、山东省自然科学基金（编号ZR2024MH073）和青岛市关键技术研究与产业化示范项目（编号25-1-1-gjgg-71-nsh）的支持。图形摘要使用Figdraw制作。
