《Microbial Pathogenesis》：Screening and Functional Validation of Host Interacting Proteins for the Key Invasion Protein LRR5 of
Mycoplasma bovis
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牛支原体LRR5蛋白通过结合宿主Vimentin蛋白介导侵袭，免疫沉淀-质谱及分子对接证实二者存在4-3关键氨基酸互作，siRNA敲低Vimentin显著抑制PG45菌株对EBL细胞的入侵（P<0.01），为开发靶向受体疫苗提供依据。
周梦婷|冯雅茹|李永昌|张戈|焦小龙|楚月峰|高鹏程|冉多良|李斌
新疆农业大学兽医学院，中国新疆乌鲁木齐830052
摘要：
牛支原体（Mycoplasma bovis）会引起牛的一系列炎症反应，给全球养牛业带来重大经济损失。该病原体通过黏附和入侵机制逃避宿主免疫反应，从而实现长期感染。因此，识别与入侵相关的毒力因子及其潜在的宿主受体对于阐明牛支原体的致病机制和开发针对性控制策略至关重要。然而，目前尚不清楚介导牛支原体入侵的毒力因子、相应的宿主受体以及它们在入侵过程中的相互作用机制。基于这一知识空白，我们假设牛支原体利用毒力因子LRR5与候选宿主受体结合，且这种相互作用是牛支原体侵入宿主细胞的关键调控因素。抑制宿主受体的表达可以部分阻止牛支原体的入侵。在本研究中，我们利用免疫沉淀-质谱（IP-MS）技术鉴定出vimentin（VIM）作为候选宿主蛋白。通过Discovery Studio Client进行分子对接分析预测了LRR5与VIM之间的相互作用位点，并利用LigPlus软件可视化了关键结合残基。LRR5和VIM蛋白之间可能存在5对相互作用的氨基酸组合，其中LRR5有4个关键氨基酸，VIM有3个关键氨基酸。体外进行的pull-down实验和在EBL细胞中进行的共聚焦显微镜实验进一步证实了LRR5与VIM之间的特异性相互作用。通过siRNA介导的VIM敲低实验结合平板计数分析表明，VIM表达的降低抑制了PG45菌株对EBL细胞的入侵能力（P < 0.01）。这些结果表明VIM可能是介导牛支原体入侵的潜在宿主受体，为开发新型控制策略（如疫苗）提供了科学依据。
引言
牛支原体（M. bovis）是体积最小的原核生物之一，直径约为0.3–0.5微米。由于缺乏细胞壁，其形态具有高度多变性[1],[2]。流行病学调查显示，牛支原体的病例致死率可高达45%[3]。先前的研究指出，新购买的犊牛和用于人工授精的未经授权的精液可能导致犊牛感染牛支原体[4]。在感染牛支原体的犊牛中，发病率可高达50%至100%，死亡率在10%至50%之间[5]。在奶牛中，牛支原体感染在老龄牛（>6岁）中的发病率为30.72%，在成年牛（>4-6岁）中为14.81%，在幼龄牛（>2-4岁）中为19.28%[6]，给养牛业带来了巨大经济损失。牛的感染通常表现为严重的肺炎[7]、关节炎[8]、乳腺炎[9],[10]、中耳炎[11]、角膜结膜炎[12]、脑膜炎、心内膜炎等多种疾病[13]。此外，牛支原体常与多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）、溶血曼海姆菌（Mannheimia haemolytica）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛呼吸道合胞病毒（BRSV）和牛疱疹病毒1型（BHV-1）等病原体共同引发多微生物感染，从而导致牛呼吸道疾病综合征（BRDC）[14]。
牛支原体通过黏附和入侵等机制感染宿主细胞，常常导致持续感染。黏附过程是指病原体利用一系列暴露在表面的黏附相关蛋白特异性结合宿主细胞受体，从而促进定植和长期存活[15]。最近的研究发现了多种参与黏附的牛支原体蛋白，包括MilA[16]、LppA[17]、LppB[18]、VSP家族成员[19],[20]、P26[21]、P27[22]、P48[23]、Mbov_0503基因产物[24]、VpmaX[25]以及一种24 kDa的蛋白[26]。黏附是牛支原体入侵的前提条件。牛支原体的入侵过程包括：牛支原体通过特定的表面黏附素与宿主细胞受体结合，触发细胞骨架和激酶调节的信号传导事件，导致膜内陷。它通过网格蛋白依赖性或脂质筏介导的内吞作用进入宿主细胞，形成囊泡并转运到早期内体，大多数菌株能够在细胞内存活并建立生态位。一些菌株从内吞囊泡中逃逸以实现持续感染，而另一些则被降解或释放到细胞外以扩散感染[27]。例如，牛支原体的LppA蛋白与宿主细胞外基质（ECM）成分和annexin A2（ANXA2）相互作用，促进黏附和入侵[17]。ANXA2可以转移到细胞表面，调节F-actin的聚合并负调控牛支原体诱导的分子反应，从而增强细菌的黏附和入侵[28]。尽管在识别牛支原体的黏附相关致病因子及其宿主受体方面取得了显著进展，但关于入侵相关毒力因子及其相应宿主受体的研究仍相对有限。这些问题构成了当前牛支原体感染分子机制研究的核心知识空白，阻碍了对初始感染过程的深入理解以及针对性控制技术的开发。
富含亮氨酸重复序列（LRR）的结构域在病毒、细菌、古菌和真核生物的蛋白质中广泛存在，具有多种功能，如信号转导、细胞黏附、DNA修复、重组、转录、RNA加工和细胞凋亡等。富含亮氨酸重复序列（LRR）的基序为病原体感染宿主提供了有利条件。例如，Adamu等人于2020年在MBOVPG45_0565基因编码的蛋白质中鉴定出一个LRR序列，证明了其参与牛支原体对宿主细胞的黏附和入侵[29]。此外，我们之前的研究在MBOVPG45_0564基因中发现了另一个LRR结构域，该基因编码的蛋白质被命名为LRR5。生物信息学分析和免疫电子显微镜显示LRR5定位于牛支原体的膜上。使用抗LRR5多克隆抗体进行的抗体阻断实验显著降低了牛支原体的入侵效率。结合透射电子显微镜、荧光微球、共聚焦显微镜和高内涵活细胞成像技术，证实了LRR5的宿主细胞入侵能力，将其确定为一种能够介导牛支原体侵入宿主细胞的新致病因子[30]。基于这些发现，我们筛选了LRR5的潜在宿主受体，并验证了相关蛋白质在牛支原体入侵中的功能重要性。
vimentin（VIM）是一种III型中间丝蛋白，在哺乳动物细胞中广泛表达。根据其氨基酸序列推算的理论分子量为约53 kDa，但由于翻译后修饰（如磷酸化）可能存在一定分子量偏差。VIM已被证实参与病原体的入侵过程，可作为多种细菌和病毒的受体或共受体[31]。它参与微生物感染的多个阶段，包括黏附、入侵、病毒基因组释放和病毒组装。例如，单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）利用VIM侵入人类微血管内皮细胞[32],[33]。此外，VIM蛋白可以与肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）的P1蛋白相互作用，促进病原体黏附[34]。总之，VIM蛋白可能是牛支原体侵入宿主细胞的潜在受体。同时，研究VIM蛋白在牛支原体感染中的作用至关重要。填补这一研究空白将有助于全面理解牛支原体感染的初始分子机制，并为开发针对性控制技术提供科学依据。
基于上述研究背景和知识空白，本研究旨在解决以下核心问题：1）筛选与牛支原体入侵相关的宿主受体；2）验证VIM是否是牛支原体侵入宿主细胞的功能性受体；3）研究VIM蛋白在牛支原体侵入宿主细胞过程中的作用。研究结果有望提供新的靶点，为控制策略的开发提供理论基础。
细胞和细菌菌株
胚胎牛肺（EBL）细胞（CVCL_2028）是研究牛病毒和细菌疾病的重要模型[35]，由甘肃农业大学的吴晓春教授提供。这些细胞在含有10%胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中培养，并在含有5% CO2的湿润环境中保持37°C。
利用IP-MS鉴定与LRR5相互作用的宿主蛋白
为了识别与LRR5特异性相互作用的宿主蛋白，我们使用了LRR5蛋白偶联的Protein A/G磁珠进行IP-MS实验，以P48蛋白作为阴性对照（第1道）。银染色用于评估潜在的蛋白质相互作用。结果显示，在LRR5样本（第2道）中出现了5个特定条带，分子量分别为140–180 kDa、60–75 kDa、45–60 kDa和25–35 kDa，而在对照组中未出现这些条带（图1A）。整个第2道
讨论
牛支原体缺乏细胞壁，因此缺乏典型的细菌致病因子，如细胞膜多糖、溶菌酶和凝集素，这使得阐明其致病机制成为一大挑战[40],[41]。
富含亮氨酸重复序列（LRR）的结构域被认为是参与蛋白质-蛋白质相互作用的重要功能域[42],[43]。Bostjan Kobe和Johann Deisenhofer[44]首次解析了LRR基序的三维结构
结论
本研究通过共免疫沉淀-质谱（IP-MS）、pull-down实验、分子对接和共聚焦显微镜等技术，确定vimentin（VIM）蛋白是牛支原体入侵相关毒力因子LRR5的特异性结合伙伴。此外，siRNA敲低实验和随后的平板计数实验表明VIM参与了牛支原体的细胞入侵过程。这些发现将VIM确定为潜在的宿主受体
CRediT作者贡献声明
高鹏程：撰写 – 审稿与编辑。李永昌：撰写 – 审稿与编辑。李斌：监督、项目管理和资金获取。周梦婷：撰写 – 初稿撰写、方法学设计、数据分析。焦小龙：撰写 – 审稿与编辑。冯雅茹：撰写 – 初稿撰写、方法学设计、数据分析。楚月峰：撰写 – 审稿与编辑。张戈：撰写 – 审稿与编辑。冉多良：撰写 – 审稿与编辑利益冲突
冯雅茹和周梦婷对本文的贡献相同，共同列为第一作者。
数据可用性声明
本研究生成或分析的所有数据均包含在发表的文章中。
伦理声明
本研究未涉及动物实验。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
资助
本研究得到了新疆维吾尔自治区自然科学基金青年项目（2023D01B33）、国家自然科学基金项目（32260885）以及阿拉木图地区科技项目“骆驼常见疾病防控及外来疾病检测技术”的支持
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
PG45-GFP菌株由中国农业科学院兰州兽医研究所的草食动物细菌疾病创新团队提供。
