含有H1N1流感病毒亚型血凝素（RBS）的重组腺病毒载体疫苗的免疫保护效果评估

《Microbial Pathogenesis》：Evaluation of immune protective efficacy of recombinant adenovirus vector vaccine containing RBS of influenza virus subtype H1N1

本研究利用人5型腺病毒载体（rAd5-GFP-RBS）靶向流感病毒HA蛋白的受体结合位点（RBS），通过鼻内给药在小鼠中诱导出强烈的系统性及黏膜免疫反应，显著提高IgG抗体滴度，降低体重损失，改善生存率并减轻肺部病理损伤，为应对H1N1亚型流感提供新疫苗平台。

　　

Bing Liu|Riaz-M Azeem|Bo Xu|Yong-Lei Yang|Rong-Rong Zhang|Man-Jie Hu|Yu-Meng Zhang|Ling-Li Liu|Rui-Bing Li|Chun-Wei Shi|Gui-Lian Yang|Hai-Bin Huang|Yan-Long Jiang|Jian-Zhong Wang|Xin Cao|Nan Wang|Yan Zeng|Wen-Tao Yang|Chun-Feng Wang

吉林农业大学兽医学院、吉林省动物益生菌工程研究中心、吉林省动物微生态与健康养殖重点实验室、教育部重大动物疾病微生态疫苗（药物）工程研究中心，中国长春市新城区街道2888号，邮编130118

摘要

目前的季节性流感疫苗平均有效率仅为20%-60%，其保护作用仅持续6-8个月。此外，一些病毒容易发生抗原漂变，导致疫苗无法充分发挥作用。由于抗原漂变，这些病毒仍然对全球健康构成威胁。因此，迫切需要开发超越传统疫苗的策略。人腺病毒5型（Ad5）载体在生物学上非常安全，能够诱导强烈的全身性和黏膜免疫反应。目前，Ad5载体已被广泛用于针对多种病原体的疫苗开发。在本研究中，我们开发并评估了一种基于腺病毒的流感疫苗（rAd5-GFP-RBS）。该疫苗针对血凝素的受体结合位点（RBS）。该疫苗通过鼻腔途径给予C57BL/6J小鼠，诱导了强烈的全身性和黏膜免疫反应，表现为血清和支气管肺泡灌洗液中的IgG水平显著升高。值得注意的是，rAd5-GFP-RBS组的支气管肺泡灌洗液中的IgG抗体滴度显著高于PBS组（***p<0.001）。在H1N1 PR8病毒攻击后，接种疫苗的小鼠存活率显著提高，体重减轻程度显著降低，肺部病理变化也比对照组轻。组织病理学和免疫组化检测证实，接种疫苗的小鼠体内的病毒抗原水平较低。测量的流感特异性抗体表明了该疫苗具有出色的保护作用。这些发现支持rAd5-GFP-RBS作为流感防护候选疫苗的潜力，为快速开发针对新出现的流感病毒株的疫苗提供了平台。进一步优化可以提高疫苗的持久性和有效性。

引言

季节性流感疫情每年导致全球大量死亡，估计死亡人数在50万到65万之间。自1918年H1N1大流行以来已经过去了一个多世纪，那次大流行造成了超过4000万人的死亡。虽然1957年、1968年和2009年的大流行致命性较低，但仍迫切需要开发一种能够同时针对季节性和大流行性流感病毒株的疫苗（Kerstetter等人，2020年）。目前的季节性流感疫苗平均有效率仅为20%-60%，保护作用仅持续6-8个月。此外，一些病毒容易发生抗原漂变，导致疫苗无法完全发挥作用。这凸显了现有疫苗的局限性（Taaffe等人，2024年；Spinardi等人，2025年）。 疫苗是控制季节性流感病毒感染的主要方法。大多数批准的流感疫苗分为两类：灭活流感疫苗（IIV）和减毒活流感疫苗（LAIV）（Raj?o & Pérez，2018年）。为了确保疫苗的安全性和有效性，灭活和减毒活流感疫苗通常通过鸡胚接种或病毒细胞培养后灭活来制备。这些方法依赖于鸡胚培养，在面对新出现的流感病毒株时疫苗开发周期较长。血凝素（HA）是免疫系统在感染或接种过程中产生的保护性抗体的主要靶标。HA是一种病毒表面蛋白，由三个单体组成，每个单体包含两个亚单位HA1和HA2，它们是由前体蛋白HA0切割产生的。HA1亚单位构成头部结构域，负责受体结合和随后的病毒内吞作用。HA1和HA2共同参与茎部结构域的形成，通过HA的构象变化促进病毒与宿主内质膜的融合，从而使病毒RNA释放到宿主细胞的细胞质中（Gamblin & Skehel，2010年）。HA是一种同源三聚体蛋白，由两个主要结构域组成：受体结合的头部结构和更为保守的茎部结构域。位于膜远端的球形头部结构域包含受体结合（RB）亚域和退化的酯酶（VE）亚域。头部结构域负责将病毒附着在宿主细胞表面受体上，而茎部结构域则通过膜融合促进病毒基因组释放到细胞质中（Fontana & Steven，2015年；Wu & Wilson，2020年）。尽管HA的球形头部具有免疫优势，但它也具有抗原变异性，容易导致抗原漂变（Jiao等人，2023年；Lin等人，2018年；Portnoff等人，2020年；Schmidt等人，2015年）。 受体结合位点（RBS）是一个位于RB亚域末端的浅疏水口袋（Wu & Wilson，2020年）。HA通过RBS与宿主细胞结合，RBS识别具有末端SA基团的受体糖脂或糖蛋白，并通过范德华力引发膜融合（Gambaryan等人，1997年；Takemoto等人，1996年；Wu & Wilson，2017年）。随后，病毒RNA被释放到宿主细胞的细胞质中进行复制。这一发现强调了RBS在病毒复制中的重要作用，促使我们继续开发针对H1N1亚型流感病毒的特异性RBS疫苗。虽然RB亚域中除RBS以外的区域高度变异且易发生抗原漂变，但HA头部结构域内有一个相对保守的区域，成为开发针对H1N1亚型流感病毒疫苗的有希望的靶标（Iba等人，2014年；Tan等人，2016年；Zuo等人，2015年）。来自PR8 H1 HA头部的RBS序列在H1亚型病毒中高度保守，反映了受体结合的功能限制。相比之下，当比较其他A型流感亚型的相同RBS片段时，只有核心框架残基保持保守，整体序列同源性较低，表明这种RBS序列主要针对H1亚型（Castro等人，2025年；Wu等人，2018年；Zhao等人，2011年）。如果这些基于RBS的疫苗能够诱导强烈的保护性抗体反应，它们有可能解决抗原漂变的问题（Ren & Zhou，2016年）。 腺病毒种类繁多，宿主范围广泛，能诱导先天性和获得性免疫，引发强烈的体液和细胞介导的抗原特异性反应，既可以通过注射也可以通过口服途径接种。人腺病毒5型（Ad5）载体被认为非常安全，因为删除了E1区域使其无法复制。除了其强大的生物安全性外，Ad5还以其能够诱导强烈的全身性和黏膜免疫反应而闻名。目前，Ad5载体已被广泛用于针对多种病原体的疫苗开发（Bliss等人，2024年；Chai等人，2025年；Sharma等人，2018年）。为了创建一个独立的疫苗生产平台，我们设计了一种编码HA受体结合位点的腺病毒（Ad）载体。我们评估了它所产生的免疫反应、RBS介导的体液免疫以及疫苗在加强免疫后对小鼠的保护效果。在H1N1 PR8攻击模型中，将其与rAd5-GFP和PBS组进行了比较。 在这项研究中，我们旨在利用人腺病毒5型（Ad5）载体作为平台，递送分泌型的单体H1血凝素（HA）抗原，以克服现有流感疫苗的局限性。通过针对HA的受体结合位点（RBS），发现该疫苗能够诱导强烈的体液免疫。我们的方法利用了Ad5载体诱导强烈全身性和黏膜免疫反应的能力，同时避免了传统生产方法的依赖。使用小鼠H1N1 PR8攻击模型，我们评估了rAd5-GFP-RBS疫苗在加强剂量后诱导RBS介导的抗体的免疫原性和保护效果。这些发现可能为开发针对H1N1亚型流感病毒的疫苗提供基础。

创新性声明

本研究介绍了一种新型的鼻内腺病毒5型载体疫苗（rAd5-GFP-RBS），该疫苗针对流感血凝素的受体结合位点（RBS）。由于RBS是流感病毒中相对保守的区域，这一策略有助于克服抗原漂变的限制。此外，Ad5载体能够实现快速疫苗生产，而鼻内给药提供了一种安全有效的途径来诱导全身性和黏膜免疫。本研究还提供了...

小鼠

我们从中国北京Vital River实验室动物技术有限公司购买了6周大的雌性C57BL/J6小鼠（序列号#20230724001）。所有动物实验均得到了兽医学院的批准，并在吉林农业大学动物重大疾病疫苗（药物）工程研究中心的动物护理和伦理委员会的监督下进行。

细胞、病毒和质粒

使用了HEK-293A（iCell Bioscience Inc，上海）细胞...

rAd5-GFP-RBS的构建与验证

为了评估H1N1流感HA蛋白RBS作为疫苗抗原的最佳性能，我们开发了一种含有绿色荧光蛋白（rAD5-GFP）的重组腺病毒5型载体（图1A）和一种基于重组腺病毒5型载体的疫苗（rAd5-GFP-RBS）（图1B）。将HEK-293A细胞以每孔2x10^5个细胞的密度接种在6孔板中并让其生长。然后用重组腺病毒感染这些细胞...

讨论

由于存在菌株特异性问题、对鸡胚生产的依赖以及每年需要重新配制和加强剂量的需求，迫切需要改进和寻找传统流感疫苗的替代方案，并开发新型流感疫苗。我们认为这种疫苗有两个主要应用方向：首先，它可以提供多年针对H1N1亚型流感病毒的广泛而持久的免疫保护（Bliss等人，2022年）。

结论

我们的研究表明，rAd5-GFP-RBS疫苗是针对H1N1亚型流感病毒的有效候选疫苗，能够引发强烈的全身性和黏膜免疫反应。rAd5-GFP-RBS疫苗可诱导高水平的IgG抗体产生，减轻体重减轻，改善存活率，并减少肺部病理变化。在H1N1 PR8攻击后，其作为有效工具的潜力得到了证实。同时，它还为相关研究提供了方向...

作者贡献声明

Yan Zeng：撰写、审稿和编辑。 Man-Jie Hu：撰写、审稿和编辑。 Wentao Yang：撰写、审稿和编辑、资源管理、项目协调、资金筹集。 Yu-Meng Zhang：撰写、审稿和编辑。 Chun-Feng Wang：撰写、审稿和编辑。 Ling-Li Liu：撰写、审稿和编辑。 Rui-Bing Li：撰写、审稿和编辑。 Chun-Wei Shi：撰写、审稿和编辑。 Gui-Lian Yang：撰写、审稿和编辑。 Bing Liu：撰写、审稿和编辑、方法学设计。 Hai-Bin Huang：... <未引用的参考文献> Lu等人，2014年。 <利益冲突> 作者声明没有已知的可能影响本文工作的竞争利益。 <致谢> 本工作得到了国家自然科学基金（32373023、32573471、3207288和U21A20261）、国家重点研发计划（2023YFD1800302）、中国农业部的中国农业研究系统（CARS-35）以及吉林省的科学技术发展计划（20240101216JC）的支持。