《Microbial Pathogenesis》：Isolation and Genomic Characterization of Novel
Escherichia Phage with Potential to Control Multidrug Resistant Extended-Spectrum βeta-Lactamase-Producing
Escherichia coli
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噬菌体92CQ高效裂解产ESBL多重耐药大肠杆菌的分离与特性研究。该噬菌体对20株临床乳腺炎分离的ESBL阳性大肠杆菌显示广谱宿主范围，裂解效能为150 pfu/细胞，潜伏期仅30分钟，且在4-50℃和pH5-11范围内保持稳定性。基因组测序（129812 bp）揭示其属于Justusliebigvirus属新物种，携带16 tRNA和250个编码序列，裂解相关蛋白复合体中含o-和i-spanin基因。该研究证实噬菌体92CQ可作为新型广谱抗菌治疗候选株，为乳腺炎防控提供新策略。
汉希卡·帕尔（Hanshika Pal）|玛尼莎·贝赫拉（Manisha Behera）|马扬克·罗尚（Mayank Roshan）|帕尔马南德·库什瓦哈（Parmanand Kushwaha）|萨奇丹南达·贝拉（Sachidananda Bera）|阿莱娜·辛哈（Aleena Sinha）|德维卡·高塔姆（Devika Gautam）|索玛·M·戈拉伊（Soma M. Ghorai）|萨奇南丹丹·德（Sachinandan De）
ICAR-国家乳品研究所（NDRI），动物生物技术中心，动物基因组学实验室，卡纳尔（Karnal）- 132001，哈里亚纳邦，印度
摘要
产生广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌是导致牛乳腺炎的最具挑战性的致病因子之一。产生ESBL的大肠杆菌出现多重耐药性，阻碍了抗生素的治疗，因此需要采用噬菌体疗法等替代方法。在本研究中，从多重耐药的ESBL产生型大肠杆菌中分离出一种属于Myoviridae家族的新型大肠杆菌噬菌体。从84份临床牛乳腺炎牛奶样本中分离出20株ESBL产生型大肠杆菌。其中85%的菌株被确认为多重耐药性菌株，45%的菌株携带针对三种或更多种抗生素的耐药基因。噬菌体92CQ是从多重耐药的ESBL产生型大肠杆菌 92CQ中分离出来的。这种裂解性噬菌体92CQ具有广泛的宿主范围，裂解效率高达150 pfu/细胞，潜伏期仅为30分钟。噬菌体92CQ在4°C-50°C的温度范围内稳定，并在pH 5-11的范围内表现出有效的裂解活性。全基因组序列分析显示，噬菌体92CQ的长度为129812 bp，包含250个编码序列和16个tRNA。在噬菌体92CQ中鉴定出由o-spanin基因和i-spanin基因组成的裂解复合体。系统发育分析表明，噬菌体92CQ属于Justusliebigvirus属的新物种。这些结果表明，所分离的噬菌体不含抗生素耐药性、毒力基因，并能有效减少多重耐药的大肠杆菌。本研究将噬菌体92CQ作为潜在的治疗候选物提出，并计划进行进一步的体内和体外研究。
引言
抗菌素耐药性（AMR）已成为一个严重的全球健康问题，对人类和动物群体都产生了深远影响[1]。据预测，到2025年至2050年间，AMR可能导致全球直接死亡3900万人，间接死亡1.69亿人，给医疗系统和全球经济带来巨大负担[2]。抗生素耐药细菌在牲畜和野生动物中广泛存在，近60%的野生动物哺乳动物携带耐药菌株，包括多重耐药菌种如耶尔森菌（Yersinia）、肠球菌（Enterococcus）和沙门氏菌（Salmonella）[3]。从食用动物（包括健康的肉鸡、牛和猪）中分离出的大肠杆菌中有90%对喹诺酮类和头孢菌素类抗生素具有高度耐药性[4]。在哥斯达黎加，野生动物中大肠杆菌的耐药率也达到了48%[5]。牛和水牛等牲畜常受到多种细菌感染（如乳腺炎），并成为抗生素耐药细菌的储存库[6]。环境因素（包括受污染的水源）以及农业和畜牧业中抗生素的无节制使用（占全球抗生素消耗量的近70%）进一步加速了耐药基因在生态系统中的传播[7]。临床、兽医、农业和食品加工领域对抗生素的依赖导致了其滥用，从而产生了耐药细菌[8]。其中最令人担忧的耐药病原体是产生广谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌，这类细菌对关键的β-内酰胺类抗生素具有耐药性，在人类和动物中日益增多[9]。在临床牛乳腺炎病例中，98%的ESBL产生型大肠杆菌携带移动遗传元件（如IS26和I类整合酶）[10]。全球范围内，人类肠道中ESBL产生型大肠杆菌的携带率约为25.4%，尤其在亚洲这一比例更高[11]。奶牛是重要的储存库，从乳腺炎等感染中经常分离出ESBL产生型大肠杆菌[12]。由ESBL产生型大肠杆菌引起的牛乳腺炎不仅导致牛奶产量下降，造成重大经济损失，还通过受污染的牛奶构成人畜共患病威胁[13]。此外，亚临床乳腺炎病例中还发现了产生志贺毒素的多重耐药大肠杆菌，进一步增加了人类严重食源性疾病的风险[14]。这些发现强调了基于“同一健康”（One Health）框架的监测和控制措施的重要性，以遏制ESBL产生型大肠杆菌在微生物组中的传播。针对多重耐药大肠杆菌这一日益严峻的挑战，噬菌体疗法作为一种精确有效的替代方案重新受到关注。噬菌体是通过裂解或溶原方式自然感染细菌的病毒[15]。具有裂解生命周期的噬菌体可以作为对抗病原菌的天然杀灭剂[16]。噬菌体具有高度特异性，仅针对病原菌，同时保留宿主的有益微生物群，从而减少可能导致耐药性进化的选择压力[17],[18]。先前的研究表明，噬菌体疗法显著减少了动物模型中的细菌负担并改善了生存结果，优于安慰剂对照组[19],[20]。从自然环境中分离出的噬菌体显示出对抗乳腺炎相关病原体的治疗潜力[21],[22]。新发现的噬菌体EF-N13针对乳腺炎牛奶中的多重耐药粪肠球菌（Enterococcus faecalis），在鼠乳腺炎模型中表现出强烈的抗菌膜活性，显著减少了细菌负荷和炎症[23]。将噬菌体疗法与抗生素结合使用还显示出协同效应，恢复了抗生素敏感性并增强了细菌清除能力——这是克服多重耐药感染的关键策略[24],[25]。这些进展强调了继续分离、表征和临床评估噬菌体的必要性，以开发针对抗生素耐药大肠杆菌的有效、个性化的噬菌体疗法。本研究重点介绍了针对ESBL产生型大肠杆菌的噬菌体92CQ的分离和生物学特性。噬菌体92CQ的基因组特征表明它属于Justusliebigvirus属的新物种，含有spanin复合体。
部分内容摘要
乳腺炎牛奶样本收集
从印度哈里亚纳邦卡纳尔及其周边地区诊断出患有临床乳腺炎的泌乳奶牛处收集了总共84份牛奶样本。在检测牛奶样本中是否存在血液、组织块和凝块后进行采集。使用加州乳腺炎测试（California mastitis test）确认了临床乳腺炎的诊断[26]。样本收集在无菌条件下，并用螺旋盖瓶保存在4°C以供进一步处理。
耐药性大肠杆菌的鉴定
从MacConkey琼脂培养基的乳腺炎牛奶样本中获得了32株乳糖发酵的粉红色菌落。在EMB琼脂上，共鉴定出20株具有独特金属绿色光泽和蓝黑色菌落的疑似大肠杆菌分离株。100%的分离株对奥沙西林（Oxacillin）、洛美沙星（Lomefloxacin）和头孢他定（Cefotaxime）具有耐药性。85%的分离株对四环素（Tetracycline）和环丙沙星（Ciprofloxacin）具有耐药性。95%的分离株对氯霉素（Chloramphenicol）敏感，50%的分离株...
讨论
乳腺炎是奶牛中最重要的细菌感染之一，不仅导致牛奶数量和质量下降，还加重了受感染动物的健康状况[46]。产生ESBL的大肠杆菌是引起牛临床和亚临床乳腺炎的主要革兰氏阴性细菌[47]。本研究旨在分离针对引起牛乳腺炎的ESBL产生型大肠杆菌的裂解性噬菌体。本研究共分离出20株...
结论
本研究旨在分离并表征针对逃避抗生素治疗的多重耐药ESBL产生型大肠杆菌的新型噬菌体。结果发现，裂解性噬菌体92CQ在体外条件下对ESBL产生型大肠杆菌具有有效的裂解活性。系统发育分析确认该噬菌体为Justusliebigvirus属的新物种。体外实验表明，噬菌体92CQ具有广泛的宿主范围...
CRediT作者贡献声明
索玛·M·戈拉伊（Soma M. Ghorai）：监督、资源提供。德维卡·高塔姆（Devika Gautam）：方法学研究。萨奇南丹丹·德（Sachinandan De）：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理。玛尼莎·贝赫拉（Manisha Behera）：撰写——初稿撰写、验证、软件使用、方法学研究、数据分析、概念构思。汉希卡·帕尔（Hanshika Pal）：验证、数据分析、数据整理、概念构思。帕尔马南德·库什瓦哈（Parmanand Kushwaha）：数据可视化、验证、软件使用。马扬克·罗尚（Mayank Roshan）：数据可视化。阿莱娜·辛哈（Aleena Sinha）：数据可视化。
数据声明
本手稿中生成的噬菌体全基因组序列数据可在国家生物技术信息中心（NCBI）GenBank中查询，登录号为PV682554.1。利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务或个人利益关系。
致谢
我们感谢ICAR-国家乳品研究所，卡纳尔（地址：132001，哈里亚纳邦，印度）的主任Dheer Singh博士在研究期间提供的必要支持和帮助。作者还感谢旁遮普大学（Panjab University），昌迪加尔（Chandigarh）的CIL和UCIM提供的TEM成像技术方面的支持和帮助。
