开发1-(5-氟戊基)-N-(2-苯基丙-2-基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-羧酰胺（5F-CUMYL-P7AICA）的认证参考物质，以实现基于质量平衡和定量核磁共振光谱的技术溯源

《Microchemical Journal》：Development of certified reference material of 1-(5-fluoropentyl)-N-(2-phenylpropan-2-yl)-1 H-pyrrolo[2,3- b]pyridine-3-carboxamide (5F-CUMYL-P7AICA) to establish metrological traceability with mass balance and quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy

5F-CUMYL-P7AICA合成及其纯度分析方法的建立，通过两步合成及柱色谱纯化，采用qNMR和质平衡法确定纯度达99.9%，填补了法医毒理领域参考标准缺失的空白。

　　

袁晓亮|余书晨|肖璐|邱婷婷|陈秀娟|王曦茹|曹芳琦|刘文斌

中国上海刑事科学技术研究院犯罪现场证据重点实验室，上海

摘要

1-(5-氟戊基)-N-(2-苯基丙-2-基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-羧酰胺（5F-CUMYL-P7AICA）是一类新型合成大麻素（SCs），属于近年来被广泛滥用的新型精神活性物质（NPS）中发展最快的类别之一。然而，由于缺乏可用于法医毒品鉴定和量刑的参考物质（RM），精确的定性分析和定量测定面临重大挑战。因此，RM或认证参考物质（CRM）对于确保化学分析结果的准确性和可追溯性至关重要。纯度为99.9%的5F-CUMYL-P7AICA通过两步反应过程自主合成，并通过双柱色谱法进行纯化。在评估其纯度时采用了两种定量分析方法：氢核磁共振光谱（1H qNMR）和质量平衡（MB）方法。1H qNMR测得的纯度为99.86%，该结果可追溯至内标物（苯甲酸）；质量平衡法测得的纯度为99.90%，同时扣除了结构相关杂质（0.05%）、无机杂质（0.000006%）和挥发性有机溶剂（未检出或含量极低）。最终确定的纯度为99.9%，扩展不确定度为0.3%（k = 2）。此外，我们计划在后续工作中应用CRM，预计这种高纯度的CRM将在法医学和量刑判断领域发挥重要作用。

引言

近年来，合成大麻素（SCs）已成为新型精神活性物质（NPS）中发展最快、变化最大的类别之一[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。这些被广泛滥用的NPS有多种吸引人的名称，如“K2”、“Spice”、“Herbal incense”、“Mojo”、“Cloud 9”等[7]、[8]、[9]，它们是一类能引起多种毒性作用的大麻素。随着SCs数量的增加，其滥用潜力和毒性对人类健康构成了威胁。由于SCs作用于I型（CB1）和II型（CB2）大麻素受体，其效果与主要的精神活性化合物四氢大麻酚（THC）相似[10]，某些SCs甚至对大麻素受体的亲和力更强[11]。因此，SCs成为NPS家族中最受欢迎的消费性药物，在2009年至2019年间主导了NPS市场[12]、[13]。在许多国家，大多数SCs仍未被列为非法药物，这使得它们能够在合法掩护下非法销售并牟取巨额利润。此外，某些SCs之间的结构相似性给准确鉴定带来了困难。同时，缺乏参考物质（RM）或认证参考物质（CRM）也使得在查获的固体粉末和生物样本中及时检测SCs变得复杂，从而削弱了执法部门的有效性。目前亟需多种分析方法以及针对SCs的RM或CRM，以便在各种基质中检测和定量SCs。因此，针对非法药物中的SCs类别进行研究，特别是开发和应用RM或CRM，对于制定毒品管制策略具有重要意义。5F-CUMYL-P7AICA的化学名称为1-(5-氟戊基)-N-(2-苯基丙-2-基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-羧酰胺，是一种基于吲唑结构的第三代合成大麻素激动剂，含有7-氮杂吲哚结构单元（见图1）。2021年，5F-CUMYL-P7AICA被添加到NFLIS-Drug数据库中[14]，2017年初也在德国的混合草药中被发现[15]。此后，关于5F-CUMYL-P7AICA的研究越来越多，包括其合成和结构表征[16]、[17]，以及其在毛发和尿液样本中的中毒案例[18]、[19]。

根据最新数据，目前市场上无法从商业公司购买到5F-CUMYL-P7AICA的CRM。开发5F-CUMYL-P7AICA的CRM并建立计量学可追溯性将具有重要意义，有助于解决法医毒品鉴定中的关键问题并辅助量刑判断。

化学试剂与溶剂

所有用于合成和分析的试剂和溶剂均为分析纯度（或试剂级），购自商业供应商。5F-CUMYL-P7AICA参考物质通过两步反应自主合成，并通过双柱色谱法纯化，总产率为80%。在这两步反应中使用了以下试剂和溶剂：乙酸乙酯、正己烷、1H-吡咯[2,3-b]吡啶-4-羧酸、1-溴-5-氟戊烷

CRM候选物的合成与制备

如图S1所示，1-(5-氟戊基)-1H-吡咯[2,3-b]吡啶-3-羧酸（3)的合成中间体可通过一步反应路线获得。将1H-吡咯[2,3-b]吡啶-4-羧酸（1)的冷却（0°C）溶液与1M K₂CO₃溶液在DMF中处理0.5小时，然后在室温下搅拌并过夜反应，同时加入1-溴-5-氟戊烷（2）。最后用水和二氯甲烷洗涤反应溶液，分离出有机相

红外光谱分析

使用配备ATR附件的Nicolet iZ10 FT-IR仪器收集候选物的FT-IR光谱，光谱采集范围为400 cm^?1至4000 cm^?1，波长分辨率为4 cm^?1，背景和样品的扫描时间为32次。

核磁共振分析

将适量的候选物完全溶解在0.6 mL的氘代试剂中，进行NMR分析，并设置相关参数，如基线校正、相位校正和接收器增益等

结构相关杂质的测定

5F-CUMYL-P7AICA中的结构相关杂质与其生产过程密切相关。这些杂质通过配备紫外检测器的HPLC系统进行定量。为了确保检测到更多杂质，在测定5F-CUMYL-P7AICA纯度之前先进行了HPLC方法的研究（见表S1–S2）。HPLC方法的研究包括优化不同的波长、色谱柱和流动相

qNMR定量

本文选择qNMR作为5F-CUMYL-P7AICA候选物定量的另一种正交方法。根据基本原则（即所选峰具有更好的对称性和更高的分辨率），优化了内标物和候选物的积分定量峰。将候选物准确称重放入玻璃小瓶中，内标物也准确称重后放入玻璃称重皿中

定性分析

在确定数值之前，确认5F-CUMYL-P7AICA的结构是首要任务。本文采用了三种方法来验证候选物的结构：傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和谱带归属（见图S3和表1）。特征吸收结果表明，N-H、C-O、C-N键属于酰胺基团；芳香环骨架也得到了确认

结论

本文通过两步反应路线合成了高纯度的5F-CUMYL-P7AICA样品，并使用IR、H-NMR和LC-MS/MS三种方法对其结构进行了验证。在数值确定过程中采用了质量平衡（MB）定量方法，严格量化了四类杂质的含量。此外，还应用了包含三个内标的qNMR方法

CRediT作者贡献声明

袁晓亮：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、数据分析、概念构思。余书晨：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、数据分析、概念构思。肖璐：撰写——审稿与编辑、数据分析。邱婷婷：撰写——审稿与编辑、数据分析。陈秀娟：撰写——审稿与编辑、数据分析。王曦茹：

资金来源

本研究得到了上海市科学技术委员会重点项目（项目编号[21dz1200200]的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。