一种新型三明治免疫荧光检测方法，用于快速定量检测人血液中的25-羟基维生素D

《Microchemical Journal》：A novel sandwich immunofluorescence assay for rapid and quantitative detection of 25-hydroxyvitamin D in human blood

维生素D缺乏的快速检测方法研究：开发一种基于双抗体夹心时间分辨荧光免疫层析法（TRFICA），实现10分钟内定量检测全血样本中的25-羟基维生素D，灵敏度达5.0?ng?mL?1，与现有金标准方法相关性系数0.9718，适用于临床和资源有限场景的便携式诊断。

　　

作者：张赛 | 向旭夫 | 刘圆珍 | 王刚 | 钱春根 | 谭晓燕

中国广东省深圳市深圳技术大学YHLO-SZTU智能诊断与精准医学联合实验室

摘要

维生素D缺乏是一个普遍的公共卫生问题，与多种健康风险相关，因此亟需快速、精确的筛查工具。本研究介绍了一种新型夹心免疫荧光检测方法，用于快速定量检测人血液中的25-羟基维生素D（25-OH VD），该方法克服了现有方法的局限性，如灵敏度低、操作复杂以及需要大量样本等。该检测方法采用一步快速解离协议，利用羧基修饰的时间分辨荧光纳米颗粒，这些纳米颗粒上标记有羊抗25-OH VD单克隆抗体（mAbs）和兔免疫球蛋白G（IgG）。免疫层析试纸由硝酸纤维素膜制成，膜上涂有鼠抗25-OH VD免疫复合物mAbs（检测线）和羊抗兔IgG抗体（对照线）。关键性能指标包括：空白限为3.0 ng/mL^?1，检测限为5.0 ng/mL^?1，批内变异系数（CV）为4.74–8.63%，批间CV为9.15–12.39%。该检测方法无明显的交叉反应或干扰，在50°C下可稳定保存8周，并且与罗氏Elecsys维生素D total III检测方法有很强的相关性（r = 0.9718，95% CI: 0.9630–0.9785，p < 0.01）。Bland–Altman分析证实了这两种方法之间的高度一致性。该方法仅需10 μL的外周血，即可在10分钟内完成敏感、特异且便携的检测，非常适合临床现场和资源有限的环境。

引言

维生素D包括麦角钙化醇（D₂）和胆钙化醇（D₃），在人体生理中起着重要作用。维生素D主要在皮肤中通过阳光照射由7-脱氢胆固醇合成，或通过饮食摄入，随后在肝脏中经过羟基化形成25-羟基维生素D（25-OH VD），再在肾脏中转化为活性形式1,25-二羟基维生素D（1,25(OH)₂ VD）。这种活性形式调节钙和磷的平衡，支持骨骼健康[1]，[2]，[3]，并影响非骨骼功能，包括心血管[4]，[5]，[6]，免疫[7]，[8]，代谢[9]，[10]，[11]和肿瘤[12]，[13]过程。由于其稳定性和较长的半衰期（2–3周），血清25-OH VD成为评估维生素D状态的主要生物标志物，反映了摄入量和内源性生成量[14]，[15]，[16]。 现有的检测方法包括液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[17]，[18]，[19]，[20]，化学发光免疫测定（CLIA）[21]，[22]，[23]，[24]和侧向流动免疫测定（LFIA）[25]，[26]，[27]。LC-MS/MS作为金标准方法具有高准确性，但需要操作人员具备专业技能、准备时间较长且设备成本高昂，限制了其在普通医院的应用。CLIA具有自动化和高通量优势，但设备维护成本高，更适合大规模实验室。LFIA在简便性、低成本和快速性方面表现出色，适用于现场检测（POCT），但在竞争性格式下常存在灵敏度和重复性不足的问题[28]，[29]。 全球有数十亿人患有维生素D缺乏症，这加剧了慢性疾病的发生，因此需要可行的筛查方法。传统的竞争性免疫测定技术存在灵敏度不足、结果不稳定、样本量需求大以及需要多步骤从维生素D结合蛋白（VDBP）中解离等问题。为了解决这些问题，我们开发了一种双抗体夹心时间分辨荧光免疫层析检测方法，该方法使用了抗免疫复合物抗体。这种夹心免疫测定方法利用了经过验证的小分子定量策略[30]，[31]，[32]，[33]，[34]，抗体特异性针对仅在抗原-抗体复合物形成时出现的新型构象表位。在试剂过量的非竞争性条件下进行检测，显著提高了检测方法的灵敏度、特异性和线性检测范围[35]。该方法将样本制备简化为一步，并将样本体积降至10 μL，特别适合婴儿和儿童等脆弱人群。在分析化学领域，该方法通过集成稳定的荧光标记和快速解离技术，推动了现场检测（POCT）的发展，促进了公平、低成本的医疗保健。

材料与试剂

2-(N-吗啉基)乙磺酸钠（MES）、牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白钠盐、Tris碱、盐酸胍、胆红素、甘油三酯、胆固醇、血红蛋白、维生素D₂、维生素D₃、1,25-二羟基维生素D₂（1,25(OH)₂ VD₂）、1,25-二羟基维生素D₃（1,25(OH)₂ VD₃以及防腐剂Proclin-300均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。交联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基磺基琥珀酰亚胺也来自Sigma-Aldrich。

TRFN及其抗体结合物的表征

TRFN具有优异的特性，如较高的荧光量子产率、较强的抗环境干扰能力、较大的斯托克斯位移（超过1 ms）以及较长的荧光寿命，这些特性共同有助于有效减轻背景荧光干扰[38]。在本研究中，使用动态光散射（DLS）技术评估了纳米颗粒的尺寸和均匀性[39]。未修饰TRFN的z-平均流体动力学直径为

结论

本研究开发了一种突破性的双抗体夹心时间分辨荧光免疫层析检测方法（TRFICA），可在短短10分钟内实现超快速地定量25-OH VD，体现了分析化学领域的创新。该方法具有3.0 ng/mL^?1的空白限（LoB）和5.0 ng/mL^?1的检测限（LoD），出色的精确度（批内CV：4.74–8.63%；批间CV：9.15–12.39%），几乎无交叉反应或干扰，并且与罗氏Elecsys维生素D total方法的临床一致性很高（r = 0.9718）。

CRediT作者贡献声明

张赛：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据整理。 向旭夫：撰写、审稿与编辑、实验设计、概念构思。 刘圆珍：资源准备、方法学设计、实验实施。 王刚：撰写、审稿与编辑、资源管理、项目协调。 钱春根：撰写、审稿与编辑、资源准备、项目协调。 谭晓燕：撰写、审稿与编辑、数据可视化、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了中国“十四五”期间国家重点研发计划的支持，项目名称为“高性能现场快速免疫分析检测系统的研发”（项目编号：2023YFC2413000）。