《Molecules and Cells》：A cryo-CLEM–guided workflow for quantitative assessment and optimization of cryo-ET specimen quality
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为解决冷冻电子断层扫描(cryo-ET)工作流程中样品制备成功率低、质量难以早期评估的瓶颈问题，研究人员系统比较了两种商用冷冻相关光电子显微镜(cryo-CLEM) Leica EM cryo-CLEM和Thermo Fisher Scientific iFLM的成像性能。研究发现，cryo-CLEM不仅能精确定位，其荧光强度还能定量关联薄片厚度与质量，为优化cryo-ET样品制备提供了非破坏性、早期评估工具，从而提升整体工作流程效率。
想要在细胞的原生环境中，以近乎原子的分辨率看清生命分子机器的结构与动态，冷冻电子断层扫描(cryo-electron tomography, cryo-ET)技术无疑是一把利器。它将细胞瞬间冻结在玻璃态冰中，再用电子束从不同角度“透视”，最终重建出三维的细胞内部景观。然而，要获得高质量的三维图像，首先要从厚度达几微米的冷冻细胞中，用聚焦离子束(Focused Ion Beam, FIB)精准地“雕刻”出仅有100-200纳米厚、且包含目标区域的超薄切片（称为薄片，lamella）。这个过程就像大海捞针，既要找到针（特定细胞区域），又要精细打磨，确保切片薄而均匀。目前，科学家们通常依赖冷冻相关光电子显微术(cryo-correlative light and electron microscopy, cryo-CLEM)来“导航”：先用荧光显微镜定位标记了荧光蛋白（如GFP）的细胞器或分子，再引导FIB进行精准雕刻。但cryo-CLEM自身的成像能力在低温条件下究竟如何？它除了导航，能否更深入地量化样品质量，为整个工作流程提供早期反馈？这些问题此前并未得到系统解答。由Minjung Kim, Junsun Park和Soung-Hun Roh团队发表在《Molecules and Cells》上的研究，正是为了回答这些问题。他们不仅像“仪器测评师”一样，量化比较了两种主流cryo-CLEM系统的性能，更开创性地发现，cryo-CLEM的荧光信号强度可以直接作为评估薄片厚度和预测最终成像质量的“标尺”，从而将cryo-CLEM从一个单纯的导航工具，升级为整个cryo-ET工作流程中的定量分析核心。
为开展此项研究，作者运用了几个关键技术方法：首先，系统性能基准测试：使用200纳米的荧光微球作为标准样品，在低温下定量测量Leica EM cryo-CLEM（独立式）和Thermo Fisher Scientific iFLM（集成在cryo-FIB-SEM平台内）两种系统的空间分辨率、信噪比和视场。其次，细胞模型成像：使用稳定表达GFP标记的自噬标记蛋白LC3的HeLa细胞系作为生物样本，在两种系统上成像，评估其在真实生物样本中的表现。第三，原位荧光监测与薄片制备：利用iFLM能够在FIB研磨过程中原位成像的特点，在制备不同厚度薄片（1500nm至200nm）时同步采集荧光图像，建立荧光强度与薄片厚度的定量关系。第四，冷冻电子断层扫描与数据分析：对筛选出的薄片进行cryo-ET数据采集，通过亚断层图平均(Subtomogram Averaging, STA)分析核糖体的分辨率，并将结果与前期测量的荧光强度相关联。
研究结果
1. 低温条件下两种cryo-CLEM系统成像性能的基准测试
研究人员首先在低温条件下系统评估了独立式EM cryo-CLEM和集成式iFLM的成像性能。使用200纳米荧光微球测量发现，两者在470纳米波长下的横向分辨率相近（EM cryo-CLEM: 0.52 μm， iFLM: 0.50 μm），轴向分辨率均约为2微米。这表明在低温条件下，系统的有效分辨率主要受限于样品本身的散射和像差，而非仪器本身的光学设计极限。然而，两者在信噪比(Signal-to-Noise Ratio, SNR) 和视场(Field of View) 上展现出互补优势：EM cryo-CLEM凭借更高的数值孔径和独立设计，信噪比高出iFLM约4.7倍，更适合快速、高对比度的筛查；而iFLM则拥有更大的视场（约500×500 μm），能提供更广的细胞环境信息，并因其与FIB-SEM集成，可实现荧光坐标与离子束坐标的直接关联。
2. 在玻璃化细胞中比较cryo-CLEM系统的成像性能
为了在真实的生物样本中验证性能，研究使用了表达GFP-LC3的玻璃化HeLa细胞。在成像通量上，EM cryo-CLEM的自动拼接成像模式使其完成3×3区域成像仅需约40秒，远快于iFLM的约4分钟。在图像后处理方面，对EM cryo-CLEM图像进行Thunder计算去卷积处理，可将信噪比提升约1.8倍，显著改善了荧光 puncta（点状结构）的清晰度；而对iFLM图像进行标准去卷积处理，效果则不明显。这进一步印证了EM cryo-CLEM在图像质量和处理灵活性上的优势，而iFLM的核心价值在于其与FIB研磨流程的无缝整合。
3. Cryo-CLEM荧光作为薄片厚度和质量的定量指标
这是本研究最具创新性的发现。研究人员利用iFLM可在研磨过程中原位成像的特性，在同一个细胞上连续制备不同厚度的薄片（从~1500 nm到~200 nm），并同步记录荧光信号。结果表明，随着薄片变薄，其内部的GFP-LC3 puncta荧光强度呈线性下降。这意味着，在样品进入最终的透射电镜成像之前，通过cryo-CLEM测量的荧光强度即可非破坏性地预估薄片的物理厚度。更重要的是，后续的cryo-TEM成像证实，荧光强度更高的区域（对应更厚的薄片，但仍处于合适范围）往往能显示出更好的图像对比度和更清晰的细胞超微结构。
4. Cryo-CLEM荧光强度作为预测薄片质量和cryo-ET分辨率的参数
为了验证荧光强度能否预测最终的结构分辨率，研究人员选取了荧光强度不同的薄片进行cryo-ET数据采集和亚断层图平均分析。结果令人振奋：从荧光强度较低（对应较薄）的薄片中提取的核糖体颗粒，经过STA后获得的分辨率（约25 ?）明显高于从荧光强度较高（对应较厚）薄片中提取的颗粒（约37 ?）。这直接确立了cryo-CLEM荧光强度与cryo-ET所能达到的分子分辨率之间存在可预测的定量关系。基于此，研究人员提出了一个以荧光强度为阈值的薄片筛选策略，能够有效地提前甄别出更有可能产出高分辨率数据的优质薄片。
研究结论与重要意义
本研究的核心结论是，cryo-CLEM不仅是一个用于精确定位的导航工具，更是一个强大的定量分析平台。通过对两种主流cryo-CLEM系统的性能量化，研究明确了它们各自的优势场景：EM cryo-CLEM擅长快速、高质量的网格级筛查，而iFLM则在集成化工作流程和原位监测方面无可替代。两者结合可以构建一个从快速初筛到精准制备再到原位评估的优化流水线。
最具突破性的发现在于，研究人员建立并验证了cryo-CLEM荧光强度与薄片厚度及最终cryo-ET数据质量之间的定量相关性。这为解决cryo-ET工作流程中长期存在的“盲目研磨”和“事后评估”瓶颈提供了革命性的解决方案。现在，研究人员可以在将样品送入昂贵且机时紧张的冷冻透射电镜之前，就利用cryo-CLEM对薄片质量进行快速、非破坏性的预筛选，从而大幅提高实验成功率和数据采集效率。
这项研究将cryo-CLEM的角色从“向导”提升为“质检员”和“预言家”，推动了冷冻电镜技术向更智能化、定量化和高效化的方向发展。它为未来整合更多模态信息（如功能荧光信号）、开发自动化与人工智能驱动的薄片质量预测模型奠定了坚实基础，标志着原位结构生物学工作流程优化迈出了关键一步。
