《Integrative Zoology》：Kaempferol Protects Intestinal Health in Chinese Forest Musk Deer Possibly by Regulating Intestinal Microbiota and Inhibiting the NF-κB/NLRP3 Signaling Pathway
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本文为读者推荐一篇整合多组学方法探究天然黄酮类化合物山奈酚对圈养林麝肠道健康维护作用的研究。作者通过网络药理学、16S rRNA测序、代谢组学及分子生物学实验，系统揭示了山奈酚通过重塑肠道菌群结构（如富集Christensenellaceae R7 group）、调节色氨酸代谢产物（如IAA、ILA）水平，并最终抑制NF-κB/NLRP3炎性体通路激活，从而降低腹泻频率、缓解肠道炎症的分子机制。研究为在抗生素限制背景下，开发绿色饲料添加剂以促进麝业可持续发展提供了新的理论依据与实践视角。
1 引言
中国林麝（FMD；Moschus berezovskii）是一种偶蹄目哺乳动物，因其产香腺体而具有极高的经济价值，麝香既是传统中医药的珍贵原料，也是高端欧洲香水的关键成分。然而，由于过度捕猎及栖息地丧失，野生林麝数量锐减。为应对此危机，我国建立了林麝人工繁育项目。尽管如此，圈养林麝种群仍面临繁殖率低、疾病易感性高等挑战，其中胃肠炎、腹泻和胃肠道出血等肠道疾病是导致其死亡的重要原因，发病率高达20%-30%，死亡率可达30%。与野生个体相比，圈养林麝的肠道菌群失调与肠道疾病的发生密切相关。目前，针对林麝肠道健康改善策略及其复杂病理生理机制的研究尚存空白。在全球禁用和减少畜牧养殖中抗生素使用的背景下，探索天然植物提取物对缓解林麝肠道健康问题的调节作用及分子机制至关重要。山奈酚（Kaempferol）是一种广泛存在于蔬菜、水果和药用植物中的天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化及调节肠道微生物群等多种生物学功能，在畜牧业、家禽养殖及水产养殖中已显示出作为新型绿色饲料添加剂的巨大潜力。
2 材料与方法
本研究采用网络药理学、饲喂试验、16S rRNA基因测序和代谢组学相结合的整合方法，评估了不同日粮山奈酚添加水平对雄性林麝肠道健康的影响，旨在确定其最佳剂量并阐明其维持肠道健康的作用机制。研究获得了西北农林科技大学实验动物管理与伦理审查委员会的正式批准。
2.1 网络药理学分析
通过网络数据库预测、文献挖掘和转录组数据筛选，共鉴定出309个山奈酚相关靶点，并从文献和基因组数据集中检索到2201个与林麝肠道疾病相关的靶点。维恩图分析确定了138个共有靶点，被认为是山奈酚作用于肠道健康的潜在节点。对这些靶点进行蛋白-蛋白互作（PPI）网络分析，并通过Cytoscape的CentiScaPe工具进行中心性分析，筛选出136个关键靶点。利用CytoHubba插件，通过Degree、MCC和MNC算法均鉴定出前10个枢纽基因，其中8个基因（BCL2, JUN, INS, CASP3, AKT1, TP53, TNF, STAT3）在所有方法中排名一致。分子对接模型显示，山奈酚与所有关键靶点均有良好的自发结合活性与亲和力，平均结合能为-4.05 kcal/mol。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，这些靶点主要富集于对氧化应激的反应、对细菌的反应等生物过程，以及癌症通路、IL-17信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路等关键炎症与免疫相关通路。
2.2 林麝饲养与样本采集
24只24月龄的健康雄性林麝被随机分为四组（每组n= 6）：对照组（C组，0 mg/kg）、低剂量组（L组，200 mg/kg）、中剂量组（M组，400 mg/kg）和高剂量组（H组，600 mg/kg）。试验为期90天，期间监测粪便评分和腹泻率。在饲喂实验的第19天早上收集新鲜粪便样本，在第90天从每组随机选择的3只林麝耳缘静脉采集血液样本。
2.3 生化分析与多组学检测
采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测粪便样本中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、免疫球蛋白G（IgG）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）和皮质醇（Cor）等生化指标水平。使用16S rRNA基因测序分析肠道菌群组成与多样性。采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）进行非靶向代谢组学分析，鉴定差异代谢物。通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测血液细胞中NF-κB/NLRP3信号通路关键基因（NFKBIA, IKKB, NFKB1, NFKB2, NLRP3）的mRNA表达水平。
3 结果
3.1 山奈酚降低腹泻发生率和粪便评分
与对照组相比，M组和H组的平均粪便评分分别显著降低了45.69%和41.25%。同时，M组和H组的腹泻频率分别比对照组显著降低了74.52%和75.68%。这些结果表明，山奈酚能显著改善林麝的肠道健康状况，且随着浓度增加，改善效果更明显，其中400 mg/kg剂量效果尤为突出。
3.2 山奈酚调节肠道健康的生化标志物
山奈酚补充显著影响了林麝的炎症、免疫和氧化应激标志物。M组和H组的IL-6和TNF-α水平显著低于对照组。同时，M组和H组的sIgA和IgG水平显著升高。在抗氧化方面，M组和H组的GSH-Px含量显著高于对照组；L组和M组的CAT含量显著高于对照组；而L、M、H三组的MDA含量均显著低于对照组。此外，400 mg/kg和600 mg/kg的山奈酚补充显著降低了林麝的Cor水平。这些结果从多角度表明山奈酚能增强林麝的肠道健康。
3.3 山奈酚影响肠道菌群多样性与组成
16S rRNA基因测序分析在门水平上显示，所有组别中最丰富的门均为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、变形菌门（Proteobacteria）和广古菌门（Euryarchaeota）。值得注意的是，M组的厚壁菌门/拟杆菌门比值高于其他三组。在属水平上，对照组特异性富集了Eubacterium siraeum group；L组特异性富集了Prevotellaceae Ga6A1 group和Campylobacter；M组特异性富集了Christensenellaceae R7 group、Bacteroides和Blautia；H组特异性富集了Candidatus Soleaferrea。基于加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）和基于Bray-Curtis差异的非度量多维尺度分析（NMDS）均显示，C组与M组之间的微生物群落存在显著差异。
3.4 M组与C组的样本比较与标志菌鉴定
线性判别分析（LEfSe）显示，M组中Christensenellaceae R7 group和Blautia的丰度更高。相反，C组中UCG-002、Prevotellaceae UCG-003、Eubacterium siraeum group、dgA-11 gut group、Rikenellaceae RC9 gut group和Candidatus Soleaferrea的丰度显著增加。这些发现表明，山奈酚能防止肠道菌群失调，这可能有助于保护肠道健康。
3.5 M组与C组的差异代谢物与代谢通路分析
非靶向代谢组学分析共鉴定出3289种代谢物，其中208种在C组和M组之间存在差异富集。与C组相比，M组有88种代谢物上调，120种代谢物下调。山奈酚处理显著提高了2-甲酰氨基苯甲酰乙酸、3-羟基邻氨基苯甲酸（3-HAA）、吲哚乙酸（IAA）和吲哚乳酸（ILA）的水平，并显著降低了犬尿喹啉酸（KYNA）、5-羟基吲哚-3-乙酸（5-HIAA）和3-羟基犬尿氨酸胺（3-HK）的水平。代谢通路分析表明，山奈酚处理显著富集了色氨酸代谢、初级胆汁酸生物合成、花生四烯酸代谢等通路。基因集富集分析（GSEA）结果进一步显示，C组和M组的系统差异表达主要富集于色氨酸代谢和胆汁分泌通路。
3.6 肠道菌群、代谢物与炎症参数的相关性分析
斯皮尔曼相关性分析显示，Christensenellaceae R7 group、Blautia和Bacteroides与IgM、IgG、sIgA、超氧化物歧化酶（SOD）、CAT、GSH-Px以及2-甲酰氨基苯甲酰乙酸、3-HAA、IAA、ILA呈正相关，而与IL-6、TNF-α、MDA、Cor以及KYNA、5-HIAA、3-HK呈负相关。相反，Rikenellaceae RC9 gut group则呈现相反的相关性模式。
3.7 网络药理学与代谢组学关联分析
将网络药理学富集的通路与代谢组学富集的通路取交集，共得到13条共同通路，包括血小板活化、色氨酸代谢、胆汁分泌、cGMP-PKG信号通路等。该结果证实了GSEA分析的可靠性，识别出色氨酸代谢和胆汁酸代谢通路是山奈酚调节肠道菌群及其代谢物以缓解林麝肠道炎症的主要途径。
3.8 山奈酚抑制NF-κB/NLRP3信号通路
RT-qPCR结果显示，山奈酚处理显著上调了NFKBIA的mRNA表达，同时显著下调了IKKB、NFKB1、NFKB2和NLRP3的表达。这些发现表明，山奈酚通过增加IAA和ILA的水平来抑制NF-κB信号通路，从而阻止NF-κB入核发挥转录激活作用，降低促炎因子TNF-α和IL-6的水平，并抑制NLRP3炎性体激活，最终缓解林麝的肠道炎症。
4 讨论
免疫功能是机体抵御外界病原入侵的关键机制，而约70%的免疫相关细胞分布于肠道。在林麝中，胃肠道疾病是人工繁育的主要瓶颈，肠道菌群失衡已被确定为林麝肠道炎症的一个特征。本研究及已有文献表明，山奈酚在维持肠道菌群稳态和缓解肠道炎症方面起着至关重要的作用。在山奈酚处理下，林麝肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的比值升高，有益菌如Christensenellaceae R7 group、Bacteroides和Blautia的丰度增加，而潜在致病菌如Rikenellaceae RC9 gut group的丰度降低。Christensenellaceae R7 group已被证明与肠道免疫系统密切相关，其丰度与短链脂肪酸（SCFAs）和抗炎因子IL-10呈正相关，与TNF-α等促炎因子呈负相关。Bacteroides和Blautia则是肠道中SCFAs和吲哚类代谢物（如IAA）的重要生产者，这些代谢物是芳基烃受体（AhR）的天然配体，能够通过激活AhR来抑制NF-κB信号通路，促进IL-22分泌，增强肠道屏障功能。
在代谢层面，山奈酚处理显著改变了色氨酸代谢流向。它提高了具有抗炎活性的吲哚类代谢物（IAA、ILA）和3-HAA的水平，同时降低了与神经毒性及促炎相关的代谢物（KYNA、5-HIAA、3-HK）的水平。IAA和ILA可通过激活AhR，抑制NLRP3炎性体组装/激活和NF-κB信号通路，从而减轻炎症。相反，色氨酸代谢的犬尿氨酸途径过度激活及其产物积累会加剧肠道炎症和屏障损伤。本研究表明，山奈酚可能通过抑制犬尿氨酸途径的过度激活，强化吲哚代谢途径，来维护肠道健康。
NF-κB和NLRP3信号通路是调控炎症和免疫反应的核心。本研究的多组学分析及实验验证共同指出，NF-κB/NLRP3通路是山奈酚维持林麝肠道健康的主要分子机制。山奈酚与菌群衍生的吲哚类代谢物协同作用，抑制了IKKB、NFKB1、NFKB2和NLRP3等关键基因的表达，同时上调了NF-κB的抑制蛋白NFKBIA的表达，从而有效阻断了促炎信号 cascades。
5 结论
本研究结果表明，山奈酚能够增加有益菌丰度，减少潜在致病菌丰度，显著提升抗炎代谢物水平，降低促炎代谢物水平，从而调控色氨酸代谢通路，抑制NF-κB/NLRP3信号通路激活，降低促炎因子表达，最终维护林麝的肠道健康。这项工作加深了对天然植物提取物维护林麝肠道健康机制的理解，为推进绿色养殖技术体系、保障林麝种群可持续发展提供了重要的理论支持和实践启示。未来研究需结合基线测量和功能验证实验（如粪菌移植），以建立微生物变化与宿主生理之间的因果关系。
