《Journal of Biomedical Materials Research Part A》：In Vitro Evaluation of Escherichia coli and Staphylococcus aureus Translocation in 3D Printed Material
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本项研究通过共聚焦显微镜等方法，深入探究了两种常见病原菌（大肠杆菌E. coli与金黄色葡萄球菌S. aureus）在三种生物材料（海藻酸钠、明胶甲基丙烯酰胺GelMA、脱细胞猪血管组织）中的渗透与突破行为。研究发现，尽管细菌渗透深度在材料间无明显差异，但脱细胞组织能显著抑制大肠杆菌的突破，而金黄色葡萄球菌在GelMA中突破率更高。这提示，与均质水凝胶相比，天然组织的异质性结构可能是未来设计抗感染组织工程血管移植物的新方向。
引言
血管移植手术是治疗冠状动脉疾病、外周动脉疾病和创伤的关键手段，每年惠及全球数百万患者。虽然自体血管移植（如使用大隐静脉）是金标准，但对于高危、缺乏合适自体血管或需小口径（<6 mm内径）移植物的患者，工程化血管移植物成为不可或缺的选择。然而，与自体移植物相比，工程化移植物存在通畅率较低、闭塞更快以及感染率更高等问题。血管移植物感染虽罕见（例如，2013年瑞士手术病例的1%–3%），但一旦发生，死亡率极高（1年内接近20%，4年内可达40%），且治疗成本高昂。尤其值得注意的是，感染多发生于术后晚期（>30天），现有的血管移植物材料抗菌涂层并未被证明能有效预防此类感染。研究表明，即使常见移植物材料本身无细菌增殖或穿透，感染仍然发生，提示缝合部位或循环系统中的细菌可能在合成移植物内存活、增殖、缓慢扩散并逃避宿主免疫防御。因此，深入了解细菌在组织工程材料中的行为，对于开发抗感染移植物至关重要。本研究旨在通过体外模型，量化两种常见细菌——大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）——在两种常用组织工程水凝胶（海藻酸钠、明胶甲基丙烯酰胺GelMA）以及脱细胞猪血管组织中的渗透与突破情况，以期为未来血管移植物的抗感染设计提供新见解。
实验方法
本研究系统比较了细菌在三种生物材料中的迁移行为。材料制备采用了三种不同工艺：2%海藻酸钠通过浇铸并在氯化钙中交联制成；GelMA则通过3D挤出打印（20 kPa, 2 mm/s，100%填充密度）成蜂窝状结构；脱细胞猪血管组织则取自10-12日龄约克夏猪的后腔静脉，经过十二烷基硫酸钠（SDS）和青霉素-链霉素处理48小时进行脱细胞，并通过过氧乙酸/乙醇进行最终灭菌。所有材料均被切割或制作为直径约3毫米的样本以供测试。
研究选用大肠杆菌（ATCC 12435）和金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）两种菌株。将细菌培养至光密度（OD600）为0.2，对应的浓度分别为~9.95 x 106CFU/mL和~2.15 x 106CFU/mL。将10 μL细菌悬液接种于每种材料的上表面，并在下方中线位置提供培养基，模拟血流提供的营养环境。分别在接种后2、4、6小时收集培养基进行菌落形成单位（CFU）计数，以量化细菌“突破”到培养基中的情况。同时，使用共聚焦荧光显微镜对材料内的细菌进行成像，并用钙黄绿素AM（标记活细胞）和溴化乙锭同型二聚体（标记死细胞）进行活死染色，以分析细菌的渗透深度和空间分布。通过ImageJ软件对图像进行分析，计算细菌在材料内的渗透深度（以质心深度衡量）。数据统计分析采用多因素方差分析（ANOVA）。
结果
首先，通过扫描电子显微镜（SEM）对材料表面形貌进行了表征。结果显示，海藻酸钠、3D打印的GelMA和脱细胞血管组织的表面在SEM下未见明显差异。不过，在海藻酸钠的裂缝中观察到了潜在的孔隙结构，直径小于5微米。
共聚焦显微镜图像清晰展示了细菌在材料内的分布情况。对于大肠杆菌，在接种2小时后，可以观察到GelMA的多孔结构似乎对细菌形成了空间约束，但此约束在4小时和6小时后不再明显。相比之下，金黄色葡萄球菌在图像中显示出更明显的聚集趋势。无论哪种细菌，都没有迹象表明脱细胞过程中使用的化学物质导致了额外的细菌死亡。
渗透深度分析：细菌渗透深度的数据显示，菌种类型对渗透深度有统计显著影响，而材料类型和时间的影响则不显著。具体而言，金黄色葡萄球菌的平均渗透深度约为2毫米，略深于大肠杆菌的平均深度（约1.5毫米）。
突破率分析：细菌突破到培养基中的情况（以Log CFU/mL表示）揭示了材料与菌种间的交互作用。在接种后2小时，所有材料和阳性对照的突破率相似。但随时间推移，差异显现：
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对于大肠杆菌，在4小时和6小时后，其在脱细胞组织中的突破率显著低于在海藻酸钠、GelMA和阳性对照中的突破率。值得注意的是，三分之二的生物学重复中，脱细胞组织内的大肠杆菌未检测到突破。
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对于金黄色葡萄球菌，在4小时后，其在GelMA中的突破率显著高于阳性对照；在6小时后，其在GelMA中的突破率也显著高于在脱细胞组织中的突破率。
多因素方差分析进一步证实，材料类型以及菌种与材料的交互作用对突破率有极显著影响，而时间因素本身的影响则未达到统计显著性。
讨论
本研究首次量化比较了细菌在组织工程水凝胶与脱细胞天然组织中的渗透和突破行为。尽管两种细菌在所有材料中表现出相似的渗透速率和深度，但在突破率上存在关键差异，特别是脱细胞组织对大肠杆菌的突破具有显著的抑制作用。
渗透行为的可能机制：细菌渗透深度无显著差异可能与实验时间较短（6小时）、取样频率有限有关，未能捕捉到可能的后期差异。两种细菌的形态和运动模式不同：金黄色葡萄球菌近似球体，主要通过滑动扩散移动；大肠杆菌为杆状，依靠“跑动-翻滚”的泳动模式。研究中观察到的孔隙尺寸（<5 μm）可能限制了大肠杆菌的泳动效率，因为其长轴（2-8 μm）在狭窄空间中可能受阻。此外，金黄色葡萄球菌通过葡萄球菌蛋白A锚定血管性血友病因子（vWF）的能力、细菌产生的表面活性剂、趋化性（大肠杆菌具备）和群体感应（两者均具备）等复杂生物学行为，都可能以未知的方式影响了它们在异质性的脱细胞组织基质中的迁移和突破。
突破率差异的意义：突破率的差异更具启示性。脱细胞组织能有效抑制大肠杆菌的突破，而对金黄色葡萄球菌的抑制效果相对较弱。一个关键假设在于材料的异质性。水凝胶（海藻酸钠、GelMA）是化学均质的，而脱细胞组织保留了天然细胞外基质复杂的化学成分和结构异质性。这种异质性可能通过多种方式阻碍细菌：例如，产生不规则的化学浓度梯度干扰细菌的趋化或群体感应导航；提供物理屏障或吸附位点限制细菌移动；或者基质中残留的生物活性成分具有抑菌作用。大肠杆菌同时依赖趋化性和群体感应，可能对异质性环境更敏感；而主要依赖群体感应的金黄色葡萄球菌受影响可能较小。这一发现为理解临床观察到的血管移植物感染“延迟发作”（>30天）现象提供了新视角：细菌可能以相似的速率渗透到移植物中，但在均质材料（或术后被宿主细胞/蛋白质均质化覆盖的区域）中更容易存活、增殖并最终突破引发感染，而在具有保护性异质结构的材料中则受到抑制。
对未来研究的启示：本研究结果指向一个未来工程学目标：将抗感染策略的重点从单纯的表面涂层，转向利用间隙生长控制和材料异质性来设计内在抗感染性能。未来的组织工程血管移植物可以有意设计具有可控异质性的结构，模仿天然组织的复杂微环境，从而在支持宿主细胞再生和整合的同时，主动抑制细菌的定植和扩散。此外，延长研究时间、使用更厚的组织、研究不同脱细胞方法的影响，以及探索缺乏特定运动或传感通路的细菌突变株，都将有助于更深入地阐明其中的机制。
结论
血管移植是拯救生命的重要医疗手段，而感染是其致命并发症之一。本研究通过对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在两种工程化水凝胶（海藻酸钠、GelMA）与脱细胞猪血管组织中迁移行为的系统比较，得出了关键结论：细菌的渗透深度和速率在不同材料间无显著差异，但突破率具有材料和菌种特异性，尤其是脱细胞组织的异质性结构能显著抑制大肠杆菌的突破。这挑战了单纯关注细菌黏附或材料孔隙率来预防感染的思路，揭示了材料本身的结构与化学复杂性在抗感染中的潜在核心作用。因此，本研究提出，在未来的组织工程血管移植物设计中，有意识地引入或模拟天然组织的异质性，可能是增强其内在抗感染能力、降低晚期感染风险的一条富有前景的新途径。
