《Neuroscience》：NMDA-receptor blockade changed microRNAs expression and apoptotic gene levels in dorsolateral striatal glioblastoma to reduce tumor growth and reverse behavioral impairments in rats
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胶质母细胞瘤（GBM）诱导行为与分子机制研究：雄性Wistar大鼠DLS植入C6胶质瘤细胞后，通过MRI和H&E染色验证GBM形成。D-AP5（6μg/rat）微注射显著降低肿瘤体积/重量（G2组 vs G1组），提高生存率，改善开放场行为及新物体识别记忆。机制上，D-AP5上调Caspase-3（9.2倍）、Bax（3.5倍）等凋亡基因，下调促肿瘤miRNA，抑制NMDAR过度激活所致神经毒性，为GBM治疗提供新靶点。
作者：Yavar Bagheri Davisaraei、Sepide Nateghi、Ladan Delphi、Fatemeh Tirgar、Fatemeh Rostami、Maryam Sardari、Fatemeh Kouhkan、Ameneh Rezayof
伊朗德黑兰大学理学院生物系动物生物学系
摘要
本研究探讨了谷氨酸能NMDA受体（NMDAR）信号通路、特定微小RNA（miRNA）和凋亡基因在雄性Wistar大鼠背外侧纹状体（DLS）中植入的多形性胶质母细胞瘤（GBM）的分子和行为特征中的作用。通过立体定向手术将C6胶质瘤细胞系植入DLS以诱导GBM（DLS-GBM），并通过磁共振成像（MRI）和苏木精-伊红（H&E）染色进行确认。在DLS-GBM诱导后第6天和第13天，使用开放场地测试评估了动物的运动活动和探索行为，发现这些行为发生了改变。此外，DLS-GBM还影响了认知功能，动物在新的物体识别测试中对相同物体的习惯化反应表明其记忆表现受损。反复在DLS-GBM内注射选择性NMDAR拮抗剂D-AP5（6 μg/大鼠）可减小肿瘤体积和重量，提高存活率，并改善行为结果。研究还发现，某些特定miRNA的水平升高与肿瘤进展相关，而D-AP5可降低这些miRNA的表达。有趣的是，D-AP5处理还增加了凋亡基因的表达，包括Caspase-3（9.2倍）、Caspase-9（5.7倍）、Bax（3.5倍）和Bak（2.7倍），表明D-AP5对胶质母细胞瘤具有抗肿瘤作用。综上所述，这些发现表明阻断NMDAR可能通过减小肿瘤大小和改善GBM相关的行为变化而带来治疗益处。此外，特定miRNA和凋亡基因表达的改变突显了它们在GBM进展和调控途径中的潜在作用。
引言
多形性胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统（CNS）中最恶性和最具侵袭性的原发性肿瘤，起源于胶质细胞（Louis等人，2021年，Louis等人，2016年）。恶性胶质瘤的特点是肿瘤细胞广泛浸润到远离原发灶的结构中，如纹状体或其他运动区域（Louis等人，2016年；Mughal等人，2018年）。GBM患者可能会出现运动和认知障碍，这可能是由于肿瘤的位置和大小直接导致，也可能是由于放疗、化疗、手术和其他治疗的间接不良后果（Kushner和Amidei，2015年；Oronsky等人，2021年）。基于人群的流行病学研究表明，大多数GBM发生在额叶、颞叶、顶叶和枕叶区域，而只有少数发生在深部脑结构中，包括基底节（Larjavaara等人，2007年）。由于深部高分级肿瘤在临床治疗上特别具有挑战性，因为手术难度大且广泛切除可能导致永久性神经损伤（Emara等人，2021年），因此动物模型对于阐明其发病机制至关重要。纹状体，尤其是背外侧纹状体（DLS），是调节运动和认知功能的主要复杂脑区之一（Gonzales和Smith，2015年；Paul Johns，2014年；Taphoorn和Klein，2004年）。一旦GBM发生在包括纹状体在内的运动区域，通常会出现运动缺陷（Taphoorn和Klein，2004年）。异常的运动功能会阻碍患者的运动能力，加重疾病预后，降低生活质量，并最终增加住院率和死亡率（Oronsky等人，2021年）。
GBM会破坏兴奋性和抑制性传递之间的平衡。纹状体中的GBM会降低长时程增强（LTP）的效能，从而改变突触可塑性。这种异常的突触可塑性可能是认知障碍的标志（Voorn等人，2004年）。普遍认为LTP和突触可塑性受到谷氨酸及其受体，特别是N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）的显著影响（Wang等人，2011年）。另一方面，过高的谷氨酸水平会导致神经元兴奋毒性（Lüscher和Malenka，2012年）。胶质瘤细胞释放出兴奋性的谷氨酸，并且星形胶质细胞的谷氨酸重吸收能力受损，导致细胞外谷氨酸水平和NMDA过度激活（Vanhoutte等人，2009年）。这一异常过程的最终结果是神经毒性及周围神经组织的神经元丢失，为肿瘤生长创造更多空间（Marcus等人，2010年；Mattson，2019年；Sontheimer，2003年）。离子型谷氨酸受体的激活促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，而阻断这些受体似乎具有抗癌效果（Groot和Sontheimer，2011年；Müller-L?ngle等人，2019年；Ribeiro等人，2017年；Rzeski等人，2001年；Walczak等人，2014年）。在所有谷氨酸受体中，Ca2+可渗透的NMDARs在GBM中的作用尚不明确。一旦NMDARs被激活，信号级联会传递到细胞核，磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（CREB）并转录存活基因（Goudar等人，2004年）。总体而言，阻断这些受体会减少细胞迁移和存活率，甚至增加对辐射诱导的细胞损伤的敏感性，这强调了这些受体作为治疗靶点的重要性（Cacciatore等人，2017年；Groot和Sontheimer，2011年）。
凋亡在调节肿瘤进展中起着关键作用，其失调是多形性胶质母细胞瘤（GBM）的标志，会导致细胞增殖失控和治疗抵抗（Valdés-Rives等人，2017年）。miRNA作为非编码RNA，参与细胞增殖信号传导、生长抑制逃避、抗细胞死亡能力、永生化、血管生成、侵袭和转移，甚至药物抵抗（Lundstrom，2011年）。一些miRNA在GBM肿瘤中的水平上调，而另一些则显著下调（Moller等人，2013年；Shea等人，2016年；Sonntag等人，2012年）。靶向肿瘤抑制mRNA的miRNA的功能在GBM中通常增强，因此其产物蛋白的细胞水平降低，这是肿瘤细胞转化的原因之一（Corsi等人，2019年；Esquela-Kerscher和Slack，2006年；Malzkorn等人，2010年）。miRNA水平的变化可以作为癌症诊断和治疗的重要生物标志物（Lundstrom，2011年）。有趣的是，miRNA可用于区分癌症的不同阶段（Condrat等人，2020年）并衡量治疗效果（Lan等人，2015年）。
许多GBM临床病例报告了行为和认知功能的改变，这表明行为测试可以作为肿瘤进展早期诊断的指标（Bosma等人，2007年；Dyk和Ganz，2019年；Jacob，2018年；Klein等人，2001年；Li等人，2020年；Meyers等人，2000年；Solanki，2017年）。由于GBM引起的纹状体谷氨酸系统过度激活可能导致神经毒性，从而引发运动和认知障碍，本研究旨在评估选择性NMDAR拮抗剂D-AP5在通过立体定向手术植入C6细胞系诱导的背外侧纹状体（DLS-GBM）中的效果。具体而言，我们还通过研究D-AP5对（i）神经缺陷、（ii）神经元存活和肿瘤生长以及（iii）携带DLS-GBM的雄性Wistar大鼠中特定miRNA水平和凋亡基因的影响，来评估其作为抗肿瘤化合物的潜力。
实验对象
本研究中使用了体重200–250克的成年Wistar大鼠，通常年龄在8–10周左右。鉴于胶质母细胞瘤在雄性中更常见，并且在发病率、生物学特性和预后方面存在性别差异，因此仅使用雄性动物来模拟主要的临床群体，并减少与性别相关的肿瘤生物学异质性（Jovanovich等人，2024年；Prosperetti等人，2025年）。四只大鼠被安置在透明的聚碳酸酯笼子中
在DLS-GBM内注射D-AP5对肿瘤的物理特性和存活率的影响
图2显示了在DLS-GBM内注射D-AP5（6 μg/大鼠/2.5 μl，共3次：第7天、第10天和第13天）对GBM/D-AP5（G2）组与GBM/生理盐水（G1）组在第14天的肿瘤体积/重量和存活率的影响。图2A、I-VI通过MRI成像确认了C6细胞植入DLS后的GBM诱导情况。如图2A、VII-VIII所示，H&E染色也表明G2组的细胞密度低于G1组
讨论
在本研究中，将C6细胞植入左侧背外侧纹状体（DLS）后形成了GBM，并在第7天和第14天进行MRI扫描以监测目标区域的肿瘤形成和大小。C6啮齿动物胶质瘤模型常用于研究脑肿瘤的病理生理学方面，包括肿瘤生长、侵袭、迁移、血管生成、信号通路和血脑屏障破坏（Giakoumettis等人，2018年）。
组织病理学
伦理声明
所有动物实验程序均获得了伊朗医科大学生物医学研究伦理委员会的批准（IR.IUMS.REC.1399.1086）。所有实验程序均遵循实验室动物护理和使用的机构指南（NIH，出版编号85–23，2010年修订版；欧盟指令86/609/EEC）。
作者贡献声明
Yavar Bagheri Davisaraei：撰写初稿、数据可视化、软件使用、方法学设计、数据分析、概念构建。
Sepide Nateghi：撰写初稿、软件使用、方法学设计、数据分析、概念构建。
Ladan Delphi：撰写初稿、软件使用、方法学设计、数据分析、概念构建。
Fatemeh Tirgar：撰写初稿、数据可视化、方法学设计、数据分析、概念构建。
Fatemeh Rostami：撰写初稿
资助
无。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢伊朗认知科学与技术委员会（CSTC）通过资助（编号9298）对本研究的支持。
