《Reproductive Medicine and Biology》：Establishment of a Novel Human Endometrial Organoid
编辑推荐：
本文报道了一种创新的无细胞外基质（ECM）人子宫内膜类器官模型的成功建立。该模型首次同时实现了上皮细胞顶端向外极性、包含基质细胞、保留激素响应性且无需ECM支持，能重现人子宫内膜的关键结构和激素反应特征。这项研究为深入探究人类着床（Implantation）机制，尤其是反复着床失败（RIF）等不孕症相关问题，提供了一个极具前景的体外研究平台。
引言背景
人类胚胎着床是一个复杂而精密的级联过程，涉及囊胚与母体子宫内膜之间的精密对话。然而，由于体内研究的伦理限制，其详细机制仍未完全阐明。尽管辅助生殖技术（ART）取得了显著进步，但反复着床失败（RIF）仍是导致不孕的主要原因之一。以往的研究依赖于二维细胞培养或小鼠模型，但存在无法再现三维结构或物种差异等问题。因此，开发能够忠实再现人类着床过程的生理相关体外系统需求迫切。
方法：新型人类子宫内膜类器官的培养建立
研究人员从山口大学医院获取不同月经周期阶段的人类子宫内膜组织样本。基于先前在小鼠中建立的方法，他们对组织进行酶消化分离，获得富含上皮的部分和基质部分，并按比例混合。将混合细胞在不使用任何细胞外基质（ECM）涂层的情况下，接种于粘附培养板中，使用特定扩展培养基培养。研究发现，当使用相当于>6000个腺体的组织量时，从第3天起可观察到子宫内膜上皮细胞（EECs）和子宫内膜基质细胞（ESCs）的自发聚集，形成小聚集体。相比之下，组织量不足时（3000腺体）则聚集不佳。免疫染色显示，这些聚集体在培养过程中实现了自我空间组织：到第6天，ESCs占据内部区域，而EECs定位在外周；到第10天，它们发育成三维Ω形结构，仅通过基底面附着于培养皿，EECs形成外层，ESCs填充核心。这种结构是类器官培养的标志——自我组织。值得注意的是，仅使用EECs而不含ESCs的培养无法形成聚集体，表明ESCs在聚集过程中起关键作用。此外，使用常规培养基而非类器官培养基也无法形成聚集体。
在大多数月经周期阶段，小聚集体易于形成。然而，对于来自早期增殖期的组织，会在第1天形成单个大聚集体。研究人员根据小鼠方案将其温和解离成小片段并重新接种，最终也能形成小聚集体，表明该方法适用于各周期阶段的组织。
第10天，将聚集体转移到低附着U形底培养皿中进行悬浮培养。在悬浮培养的3天内，覆盖外表面的透明层逐渐增厚并最终包绕整个聚集体。该透明层由EpCAM阳性的EECs构成。在此过程中，鳞状EECs转变为柱状，细胞高度显著增加。这表明悬浮培养对于生成被EECs完全覆盖的成熟类器官至关重要。
结果一：类器官具有顶端向外极性
对于着床研究，类器官需要具备顶端向外的上皮极性，以模拟囊胚附着过程。研究人员发现，在体内富集于腔上皮细胞顶端的黏蛋白-1（MUC1）和乙酰化α-微管蛋白，在类器官的EECs外表面强烈表达。此外，扫描电子显微镜（SEM）观察显示，类器官表面存在微绒毛和纤毛，这些都是顶端膜的特征。这些结果表明，类器官的上皮层具有顶端向外极性，为在囊胚共培养背景下研究着床的上皮方面提供了有用模型。
结果二：类器官展现出激素响应性
人类子宫内膜在着床窗口期受孕酮调控，发生特征性变化以接受囊胚，其中基质细胞发生蜕膜化。当用孕激素（醋酸甲羟孕酮，MPA）和环磷酸腺苷（cAMP）处理类器官后，基质区室出现了类似的形态学变化，呈现鹅卵石样形态。同时，着床窗口期在上皮和基质细胞中均上调的叉头框蛋白O1（FOXO1）在刺激后于EECs和ESCs中显著增加。着床窗口期在腔上皮细胞中升高的孕激素相关子宫内膜蛋白（PAEP）在EECs中也上调。相反，在此时期下调的孕酮受体（PGR）在EECs和ESCs中均减少。这些发现表明，该模型成功再现了EECs和ESCs中关键的着床窗口期特异性激素反应。
讨论与意义
本研究成功开发了一种新型人类子宫内膜类器官，具有四个显著特征：上皮具顶端向外极性；内区含有丰富的ESCs；无需外源性ECM包埋即可形成；EECs和ESCs均表现出激素响应性。据作者所知，这是首个同时具备所有这些特性的人类子宫内膜类器官。
类器官的形成依赖于EECs和ESCs在粘附培养条件下的自发三维聚集，ESCs对此过程至关重要，这类似于其他组织中上皮细胞与间充质干细胞的聚集机制。形成的聚集体表现出自我组织特性，EECs和ESCs以生理相关的方式排列，并且EECs获得了顶端向外极性，这可能部分归因于无外源性ECM的培养环境。
完全的EECs覆盖对于模拟有限的体内着床效率至关重要。在本模型中，悬浮培养步骤促使EECs完全覆盖暴露的基质表面并分化为柱状上皮细胞，这对生成适用于着床研究的类器官至关重要。
与仅含上皮的常规类器官相比，本模型包含内部的ESCs，能够再现着床过程中重要的上皮-基质相互作用。此外，ESCs能够在激素刺激下发生蜕膜样变化，这对于模拟滋养层细胞入侵和妊娠维持至关重要。由于类器官是通过细胞自我聚集形成，没有使用ECM，这使得细胞间接触紧密，并在上皮层下形成了致密的基质层，有利于观察囊胚与ESCs的相互作用。
该模型的另一个重要优势是其对激素刺激的响应能力，成功再现了EECs和ESCs中着床相关标志物的表达模式以及ESCs的蜕膜样形态变化。此外，该模型能够从任何月经周期阶段（包括月经期）的组织中成功生成类器官，这对于利用珍贵的人类样本具有显著优势。
局限性与未来展望
本研究存在一些局限性。首先，类器官生成需要相对大量的子宫内膜组织（约6000个腺体），对于从患有不孕症女性身上通过活检获得的有限组织量而言，需要进一步优化。其次，在体内子宫内膜的多种细胞类型中，该模型缺乏腺上皮细胞、血管内皮细胞和免疫细胞。建立能维持这些细胞类型的培养条件是未来的重要挑战。再次，与体内相比，类器官中FOXO1的核染色相对较弱，可能反映了体外着床期子宫内膜诱导不完全，提示可能需要额外的激素处理。最后，需要通过与剩余人类囊胚或诱导多能干细胞来源的囊胚样结构共培养，来验证该模型是否能再现体外着床过程。考虑到腺上皮细胞在着床中也起着重要作用，未来的研究需要进一步改进以整合腺上皮细胞。
结论
综上所述，本研究建立了一种能够再现子宫内膜体内结构和激素响应性的人类子宫内膜类器官。该模型通过EECs和ESCs在无ECM的粘附培养条件下的自我组织形成，并可从任何月经阶段获得的组织中生成。这一模型为研究人类着床机制提供了一个生理相关的平台，可能有助于阐明着床失败的根本机制。
