《Pharmaceutical Science Advances》：Recent Advances in Chemiluminescence Probes for Tumor Microenvironment with Applications in Cancer Diagnosis and Therapy
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这篇综述系统梳理了化学发光（CL）探针的最新进展，重点关注其在肿瘤微环境（TME）成像中的独特优势。文章分析了三大核心骨架（鲁米诺、过氧草酸盐、二氧化烷）的演进，并深入探讨了针对TME特征（如氧化还原失衡、低氧、酸性pH、酶活性异常）的设计策略。通过对比在肝癌、乳腺癌和肺癌等不同肿瘤模型中的应用，综述强调了肿瘤类型特异性的生化异质性对成像性能的根本影响，为开发更精准的诊断和诊疗一体化（Theranostics）工具提供了重要指导。
在癌症研究的分子影像学工具箱中，化学发光成像（CLI）正凭借其无需外部激发光的独特优势脱颖而出，为深入窥探复杂多变的肿瘤微环境（TME）提供了新的可能。
化学发光成像的核心原理与优势
光学成像能够在活体系统中对分子过程进行无创可视化，在癌症研究中扮演着重要角色。与传统磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）等宏观成像方式相比，光学成像在临床前尺度上提供了更优越的分子灵敏度和时间分辨率。而在光学成像的广阔领域中，CLI作为荧光技术的补充手段，越来越受到关注，尤其是在外部激发光受到组织自发荧光、光散射和光漂白限制的场景中。CLI的核心原理在于光子直接由化学反应产生，而非依赖外部光源激发。这意味着CL探针能将TME内源性的生化活动转化为局域化、选择性的光学信号。由于化学发光光子源于化学反应，CLI在光学特性复杂的生物环境中，如肿瘤内部，天生具备低背景噪声和高信噪比的特性。
三大化学发光骨架的演进
从分子设计的角度看，当代CLI系统通常围绕三大核心CL骨架家族展开：鲁米诺、过氧草酸盐和1,2-二氧化烷。鲁米诺化学在分析和生物医学领域历史悠久，被广泛用于报告氧化过程，包括体内应用和方法学研究。过氧草酸盐化学发光最初是作为一种高效化学激发系统建立的，为能量转移设计提供了基础，并已被改造为纳米颗粒形式用于体内过氧化氢成像。与此同时，1,2-二氧化烷引入了可化学和酶触发的激活范式，并在模块化合成、波长调控（包括近红外发射）和灵敏度增强方面经历了快速的革新。
这种演进可以从世代的角度来审视。第一代系统，以鲁米诺和过氧草酸盐化学为基础，确立了在生物环境中化学发光的可行性，但存在固有局限。第二代CLI随着触发响应型二氧化烷发光团的兴起而出现，其设计理念集中于分子可编程性。在这些化学系统中，CL发射保持沉默，直到特定的生化触发物解开发射通路，从而实现了对信号生成更优的空间和时间控制，并提高了生化特异性。当前阶段的CLI则超越了基础的探针开发，其驱动力是对临床转化和更深层生物学探索的需求。这一阶段以四个相互关联的前沿为标志：光谱向近红外/近红外II区（NIR-II，1000–1700 nm）及更远窗口的扩展，以大幅提高体内组织穿透深度和空间分辨率；从被动成像到主动干预的高级功能集成与诊疗一体化；针对TME异质性的高保真生化报告探针设计；以及面向临床应用的系统工程学。
靶向肿瘤微环境特征的设计策略
CL成像的一个显著优势在于其无激发的信号生成。光子发射直接来源于化学反应，因此CL探针可以报告那些低丰度、空间异质或瞬态的生化信号，这些信号使用依赖激发的模态难以获取。现代CL探针设计的核心原则是：有效的TME成像需要将特定的生化活动转化为可控的化学激发事件。TME响应型CL探针并非直接靶向肿瘤细胞，而是利用失调的化学过程——如氧化还原失衡、异常气体信号分子产生和酶活性——来产生局部化的光学信号，同时将背景干扰降至最低。
氧化还原失调是TME的一个普遍特征，由改变的线粒体代谢、致癌信号、免疫浸润和炎症过程驱动。因此，活性氧（ROS）和活性氮（RNS）水平的升高，包括过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2•-）、次氯酸和过氧亚硝酸盐，已被广泛用作CL探针激活的内源性触发物。早期基于CL的方法确立了体内可视化氧化应激的可行性，证明了化学激发可以作为一个直接报告者，无需外部照明。随后的分子改进提高了检测灵敏度、反应选择性和空间定位能力，使得对肿瘤组织内氧化过程的探查更加精确。
除了经典的氧化还原物种，气体信号分子如一氧化氮、一氧化碳和硫化氢在肿瘤代谢、血管生成和免疫调节中的作用日益受到认可。其中，硫化氢由于在多种肿瘤类型中产量升高，并参与氧化还原稳态和线粒体功能，引起了特别的关注。相比荧光方法，CL气体信号分子探针提供了更高的信噪比，并且对组织自发荧光的敏感性更低。这些特性在TME中尤其有利，因为气体信号分子的浓度可能具有空间异质性和时间动态性。
酶失调是TME的另一个决定性生化特征。参与代谢、细胞外基质重塑和免疫调节的酶的表达和活性变化，为可激活CL探针的设计提供了机会。酶响应系统通常依赖于底物切割或结构解掩来启动发光，从而直接将酶活性与光学输出耦合。低氧，源于异常的肿瘤血管系统和快速的细胞增殖，构成了一个互补的、具有临床相关性的TME特征。低氧响应型CL探针靶向还原性酶或氧依赖的反应通路，以可视化与侵袭性肿瘤表型和治疗抵抗相关的区域。
随着CL探针架构的成熟，越来越多的关注点转向将诊断成像与治疗功能整合。在这些系统中，CL反应不仅报告与肿瘤相关的生化活动，还启动下游的治疗过程，如光动力疗法或前药激活。在大多数报道的例子中，诊疗一体化的能力是合理探针设计的结果，而非一个孤立的目标。通过利用内源性肿瘤化学来驱动信号生成和治疗行动，基于CL的系统为实现具有内在光学反馈的空间局限干预提供了一条途径。
设计原理、失败模式与情境限制
CL探针开发中的一个常见误解是，提高分子反应性或降低激活阈值必然转化为卓越的体内成像性能。然而，在肿瘤模型中积累的证据表明，这一假设常常是无效的。在生命系统中，CL信号生成受激活化学、探针递送和肿瘤特异性生化“许可性”之间的多层相互作用支配。因此，性能限制更多地源于情境不匹配，而非化学激发机制本身的内在缺陷。
这些限制并非零星出现，而是以肿瘤类型依赖且可重复的方式显现。不同的癌症以不同的主要TME特征为标志——如氧化还原失衡、硫代谢、酶失调或低氧——这些共同定义了特定CL骨架和激活触发的有效操作窗口。从这个角度看，肿瘤模型不应仅仅被视为疾病类别，而应被视为从根本上塑造探针激活效率、信号稳定性和可解释性的、生物化学定义的评价环境。
肝细胞癌（HCC）代表了CL激活具有高度“许可性”生化环境的肿瘤情境，这归因于其显著的氧化还原失衡、活跃的硫代谢和富含酶的微环境。相比之下，乳腺癌、结直肠癌和肺癌通常呈现出更异质或更具限制性的生化条件，对激活效率和信号传播施加了更严格的约束。
对于酶激活的CL探针，其特异性在实践中所受的限制，与其说是催化效率，不如说是生物可及性。酶的异质性分布、有限的探针递送以及非恶性或炎症组织中的基础酶表达，共同限制了空间特异性，并增加了脱靶CL激活的风险。这突显了一个常被低估的重要区别：分子水平的酶特异性并不能保证组织水平的空间特异性。低氧和酸度响应型CL探针利用了侵袭性实体瘤的标志性特征，常被提议为广泛适用的成像策略。然而，这些触发因素将固有的变异性引入了CL成像系统。低氧区域通常灌注不良，直接限制了探针向预期激活区域的递送。类似地，酸性微区域往往是短暂和空间局限的，导致激活效率波动和可重复性差。
方法论考量与评价框架
CL研究中一个关键但常被忽视的问题是：许多报道的性能优势源于评估实践，而非探针固有的优越性。没有适当的方法论框架，探针的亮度、选择性和响应性可能会被系统性高估，尤其是在生化“许可性”强的肿瘤模型中。
在CL成像中，光子输出常被当作探针质量的主要指标。然而，与依赖激发的模态不同，CL系统缺乏外部能量输入，这使得观察到的信号强度对探针积累、激活效率和局部生化环境高度敏感。因此，高亮度往往反映了有利的肿瘤微环境条件，而非优越的分子设计。重要的是，在单一肿瘤模型中测得的亮度并不能提供关于稳健性、可重复性或可转移性的信息。在氧化还原活跃环境中表现出强发射的探针，在更具限制性的条件下可能会失败，即使分子结构密切相关。因此，亮度应被解释为条件性结果，而非内在的探针属性。
不同研究间CL探针性能的直接比较本质上是有问题的。肿瘤模型、给药途径、探针剂量、成像时间窗口和探测器设置的差异，都可能使表观信号输出改变几个数量级。此外，肿瘤分期和瘤内异质性进一步混淆了定量比较。这些因素共同破坏了仅基于报道的光子计数或信噪比对探针进行排序的尝试。没有标准化的实验背景，这种比较有可能将探针化学与模型特异性或程序性效应混为一谈。
并非所有报道的光学参数都对成像可靠性有同等贡献。峰值强度虽然视觉冲击力强，但常常由瞬时的激活事件主导，可能夸大表观性能。相比之下，信号持续时间、空间稳定性以及跨成像会话的可重复性等参数，为纵向或比较研究提供了更相关的信息。类似地，发射波长向近红外区域的偏移可以提高组织穿透性，但无法弥补探针递送不足或不稳定的激活化学。
多响应和逻辑门控CL探针常被提议作为应对微环境异质性的解决方案。虽然此类设计可以提高生化特异性，但它们不可避免地引入了额外的反应步骤，这些步骤会消耗反应中间体并降低整体化学激发效率。从方法论角度看，每个增加的触发因素都增加了对药代动力学变异性和递送效率低下的敏感性。在实践中，增强的分子选择性可能被降低的光子产率和增加的信号变异性所抵消。因此，复杂性应被视为一种设计成本，必须通过可证明的稳健性增益来证明其合理性，而不能假设其在选择性方面有所改进。
总结与未来展望
未来CLI的进展将取决于明确纳入肿瘤微环境条件而非依赖泛化优化的设计策略。越来越多的证据表明，CL探针很少在不同肿瘤类型中表现出均匀的性能。试图将CL探针设计泛化到不同肿瘤模型，往往会导致信号稳健性下降，而非多功能性提升。因此，肿瘤类型特异性应被视为指导性的设计原则，而非一种限制。
微环境中CL探针的异质激活促使了多响应和级联激活设计的发展。虽然这些策略可以提高生化选择性，但它们也引入了额外的反应步骤，这可能会降低CL效率并增加对药代动力学变异性的敏感性。实际上，增加的分子复杂性并不一定转化为改善的体内CL性能。多触发设计在解决特定的假激活或假阴性信号来源时最为有效，而不是试图覆盖全面的生化范围。考虑到CL系统固有的有限光子“预算”，保持足够的化学激发效率仍然是一个核心设计约束。
氧依赖性代表了许多CL激活途径的基本限制，特别是那些基于鲁米诺和过氧草酸盐化学的途径。在低氧肿瘤中，可用氧气的减少直接限制了化学激发效率，并导致信号输出的变异性。与其试图完全消除氧敏感性，未来的CL探针设计应明确地将激活机制与肿瘤氧合状态对齐。将氧气可用性视为固有约束，而非需要普遍纠正的缺陷，这与当前对低氧生物学及其对分子成像性能影响的理解是一致的。
在CLI中，递送效率和药代动力学对信号强度的影响比在依赖激发的模态中更强。因为CL系统无法通过外部激发来补偿探针积累不足，肿瘤积累、清除或脱靶分布的微小差异都可能导致成像结果的巨大变化。基于纳米技术的递送策略已显示出解决递送相关约束的潜力，特别是在穿透有限或清除迅速的肿瘤模型中。
随着该领域的不断成熟，方法论标准化将变得越来越重要。在多个肿瘤模型中比较评估CL探针、一致地报告光学参数和成像条件、以及透明地讨论局限性，对于建立可推广的设计原则至关重要。对标准化和严谨性的类似需求已在分子成像学科中得到强调，以提高可重复性和跨研究可解释性。
CL探针研究正在进入一个新阶段，其持续进展将不再由孤立的分子优化驱动，而是由化学设计与生物背景以及以性能为导向的评价的系统性整合所驱动。重要的是，化学创新仍然是这一演进的基础：在骨架工程、激活化学和发射控制方面的进步，继续扩展着CL探针在癌症诊断、TME机制研究和图像引导干预方面的功能范围和应用性。
