核受体HR96调控多种解毒基因的过表达，从而赋予Spodoptera litura（小菜蛾）对茚虫威（indoxacarb）的抗性

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Nuclear receptor HR96 regulates the overexpression of multiple detoxification genes conferring resistance to indoxacarb in Spodoptera litura

烟粉虱SlHR96核受体转录因子通过调控多阶段解毒基因（包括酯酶、糖苷转移酶和ABC转运蛋白基因）介导吲哚克昔磷抗药性，并验证其与杀虫剂代谢物直接结合。

　　

李文林|唐子|孟青琪|王恒基|史瑶|廖晓兰|史莉

湖南农业大学植物保护学院，长沙，中国

摘要

Spodoptera litura是一种极具破坏性的严重农业害虫，已经对多种杀虫剂产生了不同程度的抗性。然而，其潜在的抗性分子机制和调控机制仍不清楚。在此，我们鉴定并克隆了一种核受体转录因子SlHR96，该因子在耐印楝酯的品系中过度表达，并且在印楝酯诱导下上调。SlHR96的敲低显著抑制了多个与印楝酯抗性相关的解毒基因（SlCOE050、SlCOE090、SlUGT33J17和SlABCB3–2）的表达，从而增加了S. litura对印楝酯的敏感性。此外，双荧光素酶报告实验和酵母一杂交实验验证了SlHR96与这些解毒基因启动子的结合。分子建模和杀虫剂对接分析表明，SlHR96蛋白能够与印楝酯和DCJW结合。这些结果表明，SlHR96能够感知印楝酯和DCJW的信号，并迅速调节多个解毒基因的表达，从而赋予S. litura抗性，这对于深入理解杀虫剂抗性的调控机制和害虫管理具有重要意义。

引言

Spodoptera litura（烟草切根虫）（鳞翅目：夜蛾科）是一种极具破坏性的严重农业害虫，对棉花、烟草、甜菜、大豆、马铃薯等多种重要经济作物和蔬菜造成巨大损失（Ahmad等人，2008年；Bajpai等人，2006年）。过去几十年中，长期过量使用化学和生物杀虫剂导致许多野外采集的S. litura种群对多种类别的杀虫剂产生了高度抗性，包括拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、有机磷、氰虫腈、氟氯氰菊酯、吡啶醇、阿维菌素、苯甲酸酯和印楝酯（Li等人，2023年；Che等人，2023年；Zhang等人，2022年；Li等人，2020年；Saleem等人，2016年；Wang等人，2019年；Wang等人，2018b年；Shad等人，2011年）。印楝酯是一种噁唑类杀虫剂，对鳞翅目害虫具有优异的活性，同时对人类健康和环境的毒性相对较低。它通过酯酶或酰胺酶类型的酶切割母体化合物中的羰甲基氧基，生成活性代谢物N-脱羰甲基氧基化JW062（DCJW），后者作用于钠通道，导致昆虫迅速麻痹死亡（Song等人，2006年；Zarzoliani等人，2023年；Gondhalekar等人，2016年）。因此，基于其独特而高效的杀虫机制，印楝酯被广泛用于控制鳞翅目和鞘翅目害虫（Wing等人，2005年）。结果，许多害虫出现了对印楝酯的抗性，如Liriomyza trifolii（Li等人，2022年）、Plutella xylostella（Wang等人，2015年）、Helicoverpa armigera（Wang等人，2020年）、Tribolium castaneum和Oryzaephilus surinamensis（Khan，2020年）。

阐明杀虫剂抗性的分子基础对于延缓抗性的进化和改进害虫管理至关重要。据报道，杀虫剂抗性的进化主要通过两种机制发生：作用位点抗性和代谢抗性（Bo等人，2020年；Panini等人，2016年）。作用位点抗性通常源于杀虫剂靶标受体的敏感性降低。Aedes albopictus的钠通道中的多个位点突变（I1532T、F1534S和F1534L）已被证实与拟除虫菊酯抗性密切相关（Yan等人，2020年；Li等人，2018年；Gao等人，2018年）。Spodoptera exigua的钠通道中的V1848I突变使其对氟氯氰菊酯和印楝酯具有高度抗性（Liu等人，2024年）。Nilaparvata lugens的nAChR亚单位中的单点突变Y151S与吡虫啉抗性密切相关（Liu等人，2005年）。在P. xylostella中，ryanodine受体中的G4946E和I4790M/K突变参与了氟苯胺酰胺、氰虫腈和环虫腈的抗性（Jouraku等人，2020年；Jiang等人，2021年；Guo等人，2013年）。此外，有限的研究表明，杀虫剂抗性可能与靶标蛋白表达的变化有关（Zhang等人，2015年；Chang和Plapp，1983年）。代谢抗性主要是由于解毒酶活性的增强，这些酶将杀虫剂解毒为更易溶解或毒性较低的化合物，从而促进其更快排出。这一过程可分为三个阶段：第一阶段，酯酶/羧酸酯酶（CarEs）和细胞色素P450单加氧酶（P450s）催化外源物质的氧化、还原和水解反应；第二阶段，谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和尿苷二磷酸（UDP）葡萄糖基转移酶（UGTs）催化形成更易溶于水或无毒的结合代谢物；第三阶段，ATP结合盒（ABC）转运蛋白将第一或第二阶段产生的代谢物排出细胞（Wang等人，2018a；Hilliou等人，2021年；Ye等人，2022年）。越来越多的研究表明，解毒基因的过度表达显著促进了昆虫的抗性。例如，在P. xylostella中，PxαE6和PxαE9在抗性品系中过度表达，赋予其对福美双的抗性（Li等人，2024c）。在Leptinotarsa decemlineata中，CYP9Z140、CYP9AY1和UGT321AP1在抗性种群中上调，敲低这些基因后暴露于噻虫嗪时死亡率显著增加（Wang等人，2024c）。在Aphis gossypii中，两个上调的UGT350C3和UGT344L7赋予其对吡虫啉、啶虫脒和噻虫嗪的抗性（Li等人，2024b）。在Spodoptera frugiperda中，SfABCG10的上调促进了其对氰虫腈的抗性（Wang等人，2024a）。在我们的先前研究中，已经证明多个P450s、CarEs、UGTs和ABC转运蛋白基因的过度表达参与了S. litura对印楝酯的抗性（Li等人，2024e；Shi等人，2022年；Yang等人，2023年；Shi等人，2019年）。然而，关于这些解毒基因的转录调控机制的研究仍不够深入。

解毒基因表达的变化通常与转录因子有关。在哺乳动物中，已有三种主要的转录因子超家族被报道可以调节外源物质诱导下的解毒基因表达：基本螺旋-环-螺旋/Per-ARNT Sim（bHLH-PAS）、基本亮氨酸拉链（bZIP）和核受体（NR）（Kalsi和Palli，2015年）。激素受体样96（HR96）属于核受体转录因子家族，一些研究表明HR96调节解毒基因的表达，并介导节肢动物对杀虫剂和外源物质的抗性（Kirst等人，2006年；Gao等人，2022年）。在Tetranychus urticae中，一个与HR96相关的基因可能促进解毒基因的上调，有助于杀虫剂耐受性和寄主植物适应性的进化（Ji等人，2023年）。在Panonychus citri中，pcHR96h与多个解毒基因的过度表达相关，并有助于对螺虫丹的抗性（Li等人，2024d）。同样，在T. castaneum中，TcHR96介导的吡虫啉抗性显著增强了包括CYP345A1、CYP4Q4、CYP4BR3和CYP4G7在内的解毒基因启动子的活性（Kim等人，2021年）。

本研究首先分析了SlHR96的表达模式和生物信息学特性。然后，应用RNAi技术研究了SlHR96在印楝酯抗性中的关键作用及其对解毒基因表达的调控效应。此外，通过双荧光素酶报告实验和酵母一杂交实验验证了SlHR96与解毒基因（SlCOE050、SlCOE090、SlUGT33J17和SlABCB3–2）之间的调控关系。最后，通过同源性建模和分子对接分析了印楝酯/DCJW与SlHR96蛋白的结合关系。本研究将提供明确证据，证明SlHR96通过上调包括CarEs、UGTs和ABC转运蛋白在内的多个解毒基因的表达，赋予S. litura对印楝酯的抗性。

部分内容摘录

昆虫品系和生物测定

本研究使用了三种S. litura品系。敏感品系（SS）来自中国科学院动物研究所，该品系在实验室中已连续饲养40代以上，未接触过杀虫剂。实验室筛选出的耐印楝酯品系（InRS）是从SS通过连续印楝酯处理获得的。田间筛选出的耐印楝酯品系（FInRS）来自湖南省长沙。

转录因子SlHR96

的表达模式分析

通过qPCR定量分析了不同品系、组织和印楝酯诱导的S. litura中SlHR96的表达模式。结果显示，InRS和FInRS品系中的SlHR96表达显著上调，其表达水平分别比SS品系高2.26倍和2.93倍（图1A）。SlHR96存在于所有组织中，其中中肠（6.10倍）和马尔皮基管（5.38倍）中的转录水平最高，而头部中的表达水平最低（图1B）。

讨论

HR96是无脊椎动物中CAR/PXR/VDR的直系同源物，是一种广谱特异性核受体，能够感知内源性和外源性物质，并调控解毒适应（Sengupta等人，2015年）。HR96具有两个核心结构域：高度保守的DNA结合结构域（DBD）和较低保守的配体结合结构域（LBD）。DBD负责序列特异性的DNA识别，而LBD构成配体结合口袋和转激活结构域（Muthu Lakshmi Bavithra等人，

CRediT作者贡献声明

李文林：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理。唐子：验证、数据管理。孟青琪：软件、研究。王恒基：软件、研究。史瑶：软件、研究。廖晓兰：监督。史莉：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取。

未引用参考文献

Cao等人，2024年

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号32372591）、湖南省科技创新计划（编号2024RC3186）和湖南省现代农业产业技术体系（编号2022-31和2022-42）的支持。