《Redox Biology》：Apolipoprotein C3 exacerbates vascular calcification by promoting ferroptosis via the TLR2/AMPK pathway in vascular smooth muscle cells
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本研究聚焦于慢性肾衰竭（CRF）患者中高发的血管钙化（VC）问题，该病症是心血管疾病发病与死亡的重要风险因素，目前缺乏有效的药物干预手段。文章揭示了血浆载脂蛋白C3（ApoC3）水平与VC正相关，并首次阐明了ApoC3通过结合Toll样受体2（TLR2）、抑制AMPK/NRF2信号通路、下调SLC7A11/GPX4轴，从而增加脂质过氧化、促进血管平滑肌细胞（VSMCs）铁死亡，最终加剧钙化的新机制。研究成果发表于《Redox Biology》，为靶向ApoC3治疗VC提供了重要的实验证据和新思路。
想象一下，人体的血管本该像富有弹性的橡胶水管，保持血液顺畅流通。然而，在某些疾病状态下，血管壁上会像水垢一样沉积钙盐晶体，这个过程被称为血管钙化（Vascular Calcification, VC）。它让血管变硬、变脆，是导致心血管疾病发病和死亡的重要因素，尤其在慢性肾衰竭（Chronic Renal Failure, CRF）患者中极为普遍。遗憾的是，目前临床上还没有特效药能有效阻止或逆转这一过程，这成为了心血管疾病防治领域的一大难题。
近年来，科学家们将目光投向了一种叫做“铁死亡”（Ferroptosis）的新型细胞死亡方式。它与我们熟知的细胞凋亡不同，其核心特征是铁依赖性的脂质过氧化。有研究表明，铁死亡会加剧VC，但其上游的调控因素和精确机制仍不明确。与此同时，一种名为载脂蛋白C3（Apolipoprotein C3, ApoC3）的蛋白走进了研究者的视野。它不仅是调节甘油三酯代谢的“明星分子”，大规模临床研究还发现，血浆ApoC3水平与冠状动脉钙化呈正相关，提示它可能是VC的一个风险因素。但是，ApoC3与VC之间究竟是简单的伴随现象，还是存在直接的因果联系？如果是后者，它又是如何起作用的？这些关键问题亟待解答。
为了回答这些问题，来自北京大学健康科学中心心血管研究所的Zihao Zhou、Jinxuan Chen、Huan Wang等研究人员在《Redox Biology》期刊上发表了一项系统性研究。他们综合利用临床样本、基因修饰小鼠模型、离体动脉环培养和体外细胞实验，首次揭示了ApoC3通过激活TLR2/AMPK通路，诱导血管平滑肌细胞铁死亡，从而加剧VC的全新机制，并论证了靶向ApoC3作为VC治疗新策略的潜力。
研究人员用到的主要关键技术方法包括：
- 1.
多层次模型构建：建立了5/6肾切除联合高磷饮食诱导的CRF小鼠模型、维生素D3（VitD3）过载小鼠模型，以及高磷浓度培养基诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）和离体动脉环钙化模型，实现了从在体到离体、体外的全面验证。
- 2.
基因操作技术：使用了ApoC3转基因（Tg）和基因敲除（KO）小鼠，以及在细胞水平通过腺病毒（Ad-ApoC3）过表达、小干扰RNA（siRNA）敲低ApoC3或TLR2，精确操控目标基因表达以验证其功能。
- 3.
钙化与细胞表型评估：采用阿尔新红（Alizarin red S）和冯科萨（von Kossa）染色观察钙盐沉积，并定量检测钙含量和碱性磷酸酶（ALP）活性；通过蛋白质印迹（Western blotting）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测成骨标志物（如RUNX2, BMP2）和收缩标志物（如SM22α）的表达。
- 4.
铁死亡指标检测：综合运用免疫荧光染色检测脂质过氧化产物4-HNE和活性氧（ROS），使用特定荧光探针（FeRhoNox-1）检测细胞内游离Fe2+，并通过生化试剂盒定量检测丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量以及细胞活力，全面评估铁死亡水平。
- 5.
分子机制探究：利用蛋白质印迹法检测TLR2、磷酸化AMPK（pAMPK）、核因子NF-E2相关因子2（NRF2）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）等关键蛋白的表达；通过免疫共沉淀（Co-IP）验证ApoC3与TLR2之间的相互作用。
研究结果部分：
研究人员首先发现，在CRF患者和模型小鼠的钙化动脉中，ApoC3的mRNA和蛋白表达水平均显著上调，并与成骨标志物RUNX2的表达正相关。免疫荧光显示ApoC3在血管平滑肌细胞（VSMCs）中表达，且在钙化状态下表达增加，同时VSMCs的收缩标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达下降。在高磷诱导的钙化VSMCs中，也观察到同样的ApoC3表达升高现象。
在CRF或VitD3诱导的钙化模型中，与野生型（WT）小鼠相比，ApoC3转基因（Tg）小鼠的主动脉钙化病变更严重，钙沉积和ALP活性更高，成骨标志物（RUNX2, BMP2）表达上调而收缩标志物（SM22α）表达下调。相反，ApoC3敲除（KO）小鼠的血管钙化程度显著减轻。在体外实验中，过表达ApoC3（通过腺病毒或质粒）的VSMCs在高磷条件下表现出更严重的钙化，而敲低ApoC3则能缓解钙化。
ApoC3在钙化主动脉和VSMCs中加剧铁死亡并降低SLC7A11/GPX4
机制探索发现，ApoC3过表达加剧了钙化组织和细胞中的铁死亡，具体表现为脂质过氧化产物4-HNE和MDA增加、铁离子（Fe2+）和ROS水平升高、促铁死亡基因Ptgs2表达上调、细胞活力下降以及抗氧化物GSH减少。同时，抗铁死亡的关键蛋白SLC7A11和GPX4的表达被抑制。反之，ApoC3缺陷则能减轻铁死亡，并上调SLC7A11和GPX4。
ApoC3通过激活TLR2抑制钙化主动脉和VSMCs中的AMPK/NRF2通路
研究人员进一步揭示了上游信号通路。免疫共沉淀和免疫荧光证实ApoC3能与TLR2结合，且这种相互作用在钙化条件下增强。ApoC3过表达会上调TLR2，并抑制AMPK的磷酸化（即激活受抑）及其下游转录因子NRF2的核转位。而敲低TLR2则能逆转ApoC3过表达导致的AMPK/NRF2通路抑制、铁死亡加剧和钙化增强。
激活AMPK或NRF2可减轻ApoC3诱导的VSMCs铁死亡和钙化
使用AMPK激动剂AICAR或NRF2激动剂萝卜硫素（SFN）处理过表达ApoC3的钙化VSMCs，可以有效激活AMPK/NRF2通路，上调SLC7A11和GPX4，从而抑制铁死亡并减轻细胞钙化。
抑制SLC7A11或GPX4可削弱ApoC3沉默对VSMCs铁死亡和钙化的保护作用
在敲低ApoC3的VSMCs中，如果再使用SLC7A11抑制剂HG106或GPX4抑制剂RSL3，则会重新诱发铁死亡并加剧钙化，证明SLC7A11/GPX4轴是ApoC3调控下游表型的关键效应通路。
铁死亡抑制剂减轻了ApoC3诱导的主动脉和VSMCs铁死亡和钙化
在VitD3诱导的ApoC3 Tg小鼠模型中，使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）治疗，可以显著减轻主动脉的钙化和铁死亡指标。在细胞实验中，Fer-1或另一种抑制剂Liproxstatin-1（Lip-1）也能有效逆转ApoC3过表达导致的VSMCs铁死亡和钙化。
ApoC3加剧小鼠主动脉环的铁死亡和钙化，抑制ApoC3改善人肾动脉环的铁死亡和钙化
离体动脉环实验排除了血浆脂质水平的干扰，直接证实ApoC3过表达或缺陷能分别加剧或减轻动脉环的钙化和铁死亡。更重要的是，在人肾动脉环中敲低ApoC3，能显著减轻高磷诱导的钙化和铁死亡，这为ApoC3作为治疗靶点提供了直接的人源组织证据。
研究结论与讨论：
本研究首次系统性地证实了ApoC3是VC的一个关键促进因子，并阐明了其作用不依赖于其调节甘油三酯的传统功能，而是通过一种全新的机制：ApoC3作为内源性配体与VSMCs上的TLR2结合，抑制AMPK/NRF2信号通路的激活，进而下调抗铁死亡核心轴SLC7A11/GPX4的表达，最终导致铁死亡水平升高，驱动VSMCs向成骨样表型转化，加剧血管钙化。
这项研究的意义重大。首先，它将已知的VC风险因子ApoC3与新兴的铁死亡机制联系起来，为理解VC的复杂病理过程提供了新的视角和理论基础。其次，研究明确指出了TLR2/AMPK/NRF2/SLC7A11/GPX4这一信号轴是ApoC3发挥作用的关键通路，为药物研发提供了多个潜在的干预节点。最后，也是最具转化价值的是，研究利用人源组织证实了抑制ApoC3能有效缓解钙化，这强烈提示靶向ApoC3（例如使用已有的ApoC3 siRNA疗法如Plozasiran）有望成为治疗VC，特别是CRF相关VC的一种崭新策略。尽管ApoC3在钙化环境中上调的具体原因（如可能与过氧化物酶体增殖物激活受体α即PPARα的表达下调有关）以及ApoC3是否也通过TLR2/核因子-κB（NF-κB）等炎症通路参与VC等问题仍需未来探索，但本研究无疑为攻克这一临床难题点亮了重要的方向。
