高效的单细胞裂解技术结合了微孔阵列和AgPDMS电极，能够在裂解后实现良好的细胞封闭效果，从而有效保留细胞

《Sensors and Actuators A: Physical》：High efficiency single-cell lysis in microwells integrated with AgPDMS electrodes with high post-well-sealing cell-retention

单细胞裂解技术研究中，提出了一种基于电场激活的微流控装置，通过PDMS与AgPDMS复合结构实现油封和电场精准控制，解决了传统物理封盖导致的细胞逃逸问题，裂解效率达98.93%且细胞保留率93.88%，兼容脉冲直流和正弦波电压激活，并验证了其在 caspase-3 酶活性检测中的应用。

　　

姚彩|费苏|成武汉|杜丽宇|袁罗|肖星星

北京化工大学信息科学与技术学院，中国北京市北三环东路15号，邮编100029

摘要

细胞裂解是单细胞分析中提取细胞内成分的关键前提。与使用化学试剂的传统裂解技术相比，电学方法无需担心抑制细胞内酶活性。更重要的是，它能够在封闭单个细胞捕获容器后更可控地启动裂解过程，从而完全避免细胞内物质的扩散损失或交叉污染。然而，现有的单细胞电学裂解平台通常需要依赖洁净室环境进行复杂且昂贵的制造。此外，基于微孔的电学平台通常使用物理盖子来封闭微孔，这会导致捕获细胞的明显损失。这种直接封闭策略可能还会导致电流分散。在本文中，我们展示了一种创新的电学方法用于单细胞裂解的微装置。该装置具有两层结构：下层为PDMS微孔层，用于捕获单个细胞；上层为电液层，电极和流道集成在AgPDMS复合材料中。这两层均通过低成本且简单的复制成型工艺制造而成。同时，流道能够实现缓冲液交换，并以温和的方式实现微孔的无泄漏密封，解决了物理盖子导致的细胞逃逸问题，即使在缓冲液清洗和密封后，也能保持93.88%的高细胞保留率。电场分布的数值模拟显示，在密封后电场严格限制在微孔内部，单个细胞由微孔的隧道结构整流的均匀三维电场激活。该装置分别使用直流脉冲和交流电压进行了测试，并通过参数研究优化了关键设置。两种激活方式分别实现了98.93%和98.34%的较高裂解率。我们还使用该装置对caspase-3的酶活性进行了测试，以验证其在单细胞分析中的可行性。鉴于其高裂解效率、封闭后的高细胞保留率以及简单的制造工艺，我们认为这种经济高效的装置可以成为单细胞分析（如单细胞组学）的强大工具。

引言

近年来，单细胞技术已成为单细胞基因组学、转录组学和蛋白质组学领域取得显著进展的强大工具[1]、[2]、[3]。通过分析单个细胞内的分子（如DNA、RNA或蛋白质），它可以揭示整个细胞群体中的异质性，而这些异质性在批量分析中常常被平均信号所掩盖[4]、[5]、[6]。对于单细胞内含物分析，每个细胞通常会被捕获在独立的容器中，例如通过FACS分选的多孔板、通过沉淀形成的微孔阵列或液滴封装。随后进行细胞裂解，以破坏细胞膜，从而提取细胞内物质。

细胞裂解可以通过多种方法实现，包括传统的化学裂解方法，以及基于外部场的裂解方法，如电场、机械场、光场、热场和声场[7]、[8]。化学裂解作为一种传统方法简单有效，通常使用含有去污剂的试剂来溶解细胞膜中的脂质和蛋白质[9]、[10]、[11]。它也是高通量裂解封装在微孔或液滴中的单个细胞的最常用方法，适用于单细胞基因组学、转录组学或蛋白质分析[12]、[13]、[14]。选择合适的试剂对于化学裂解至关重要[15]、[16]。例如，强离子去污剂如十二烷基硫酸钠（SDS）可以在几秒钟内快速裂解细胞，但可能导致蛋白质变性，因此通常用于DNA/RNA提取或蛋白质电泳分离[16]。相比之下，较温和的去污剂如Triton X-100作为非离子去污剂，虽然裂解速度较慢，但与下游分析（如酶活性测定）更为兼容[16]、[17]。对于微孔阵列中的高通量单细胞分析，一个具有挑战性的问题是裂解后细胞物质的扩散导致的物质损失和交叉污染[18]、[19]。这是因为细胞裂解必须与裂解试剂的加载同时进行。因此，需要熟练的人员快速操作微孔封闭或直接进行下游处理[18]、[20]，以最小化物质稀释和干扰。

另一种方法是电学方法，它具有高效的裂解效果，并避免了繁琐的裂解试剂加载过程，同时减轻了蛋白质变性的问题[15]、[16]，因此已被证明广泛应用于基因操作[21]、[22]或与蛋白质相关的测定（如酶活性测试[23]、[24]、[25]）。电学裂解是通过施加电场产生跨膜电位（TMP）来实现的，足够高的电场可能导致细胞膜不可逆的破坏。研究人员研究了薄膜或三维设计的微电极、脉冲直流或交流的激活信号类型，以及静态或连续流动的工作模式，最近的综述文章对此进行了很好的总结[7]、[15]、[16]。尽管电学方法尚未像化学裂解那样普及，但它为在封闭微孔后可控地启动细胞裂解提供了关键优势，完全消除了物质损失或交叉污染的风险。例如，在预刻有金属电极的玻璃盖子密封的PDMS微孔阵列中，以及在井底刻有ITO电极并用PDMS膜封闭的SU8微孔中，已经实现了高效的单细胞裂解[23]、[25]。这些方法的一个问题是封闭微孔的策略，直接用盖子封闭可能导致超过20%的细胞损失[23]。同时，这些装置通常使用在井底或顶部刻制的互指型薄膜电极，这可能导致电极边缘附近的局部膜过早破坏。此外，无论是密封还是未密封的基于微孔的单细胞裂解平台，通常都需要依赖洁净室环境的复杂且昂贵的制造工艺，例如贵金属的沉积和图案化[23]、微孔和图案化电极的对准光刻[25]、[26]，以及深度硅刻蚀[27]。

在本研究中，展示了使用银-PDMS（AgPDMS）微电极在油密封微孔阵列中的单细胞裂解。如图1所示，3D AgPDMS侧壁电极之间形成的微通道促进了油密封和缓冲液交换。电激活最终通过连接圆形捕获区域的隧道结构传递到细胞。整个装置，包括PDMS微孔层和由AgPDMS制成的电液层，均通过简单的低成本复制成型工艺制造而成，使用了可重复使用的母模。K562细胞的裂解效率高达98.93%。通过优化装置设计，即使在封闭细胞捕获的微孔后，也获得了93.88%的高细胞保留率。该装置还被验证可以与不同的激活电压类型（脉冲直流和正弦波电压）兼容。同时，我们研究了关键参数对裂解效率的影响，包括脉冲幅度和数量，以及正弦波幅度和频率。最终通过单细胞酶活性测量（caspase-3）验证了该装置的有效性。凭借高细胞保留率和裂解率，以及易于制造和操作的特点，我们预计该装置有望应用于各种类型的单细胞分析。

设计与工作原理

图1a展示了装置设计的三维示意图。该装置由顶部的电液层组成，其中在一对AgPDMS制成的三维侧壁电极之间形成了一个主通道。主通道连接三个入口孔和一个通过AgPDMS电极顶部的PDMS盖子打出的出口孔。在电液层下方是位于玻璃手柄层上的PDMS层中的微孔，其中800个微孔排列成队列

制造好的装置

图2b-c显示了在 bonding 过程之前制造好的电液层和微孔层的SEM图像。图2b展示了电液层的上游部分。一个90 μm宽的主通道出现在一对50 μm厚、5 mm宽的3D AgPDMS侧壁块之间，这些侧壁块也充当了整体电极。主通道在上游分支成三个宽度相同的90 μm的子通道，连接缓冲液、样品和油的入口

讨论

如上所述，我们的装置已被验证可以与直流脉冲和正弦波电压兼容，在优化设置下分别实现了98.93%和98.34%的较高裂解率。这些裂解率与现有用于单细胞裂解的电学平台报告的裂解效率（87%至约100%[23]、[25]、[46]）相当

结论

总之，我们展示了一种使用电学方法在密封微孔中高效裂解单个细胞的微流控装置。该装置具有易于制造的AgPDMS电液层，位于PDMS微孔层之上。夹在3D AgPDMS电极之间的流道便于进行油密封操作，并确保了封闭后的高细胞保留率93.88%。油密封还严格限制了电场路径

作者贡献声明

肖星星：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，项目管理，方法论，研究，资金获取，概念化。姚彩：撰写 – 原稿，验证，资源获取，研究，正式分析，数据管理。杜丽宇：监督，资金获取。袁罗：撰写 – 审稿与编辑，监督。费苏：项目管理，资金获取。成武汉：项目管理，资金获取。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了“北京市昌平区科学技术副主任”项目（项目编号202501015015）、中央高校基本科研业务费以及国家高水平医院临床研究经费（项目编号2023-NHLHCRF-YXHZ-TJMS-03）的支持。

利益冲突

无。

姚彩在中国北京化工大学生命科学技术学院获得了硕士学位，目前是北京化工大学信息科学与技术学院的博士生。她的研究兴趣主要包括用于单细胞分析和细胞转染的微流控技术。