《Sensors and Actuators B: Chemical》：Noninvasive Monitoring of Skin pH Changes Induced by Microneedle Electroporation
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皮肤表面pH值对表皮稳态和屏障功能至关重要。本研究采用高分辨率比值荧光成像技术，结合8-羟基-1,3,6-三磺酸-1,3,6-三苯基四氮唑探针和共聚焦显微术，首次实现了对微针电穿孔过程中皮肤微环境pH变化的实时原位定量分析。实验证实，直流电穿孔在电极正极区域引起显著酸化（最大pH偏差1.11，p<0.001），而交直流正弦波电穿孔可有效抑制pH变化，维持生理pH梯度。这一发现为优化电穿孔技术提供了重要理论依据。
作者：邓宁·夏（Dengning Xia）、黄宇（Huan Yu）、宋莉（Song Li）、马克·R·普劳斯尼茨（Mark R Prausnitz）
单位：中山大学深圳校区药学院，中国深圳518107
摘要
皮肤表面的pH值在维持表皮稳态和屏障功能方面起着关键作用。微针电穿孔技术是经皮药物和基因递送领域的一项重要进展；然而，伴随发生的电化学反应可能对皮肤pH值造成扰动，但这些反应尚未经过实验研究。本研究建立了一种定量、无创的分析方法，用于原位观察和测量这些微环境变化。我们采用了高分辨率的比率荧光成像技术，结合pH敏感探针8-羟基-1,3,6-芘三磺酸（8-hydroxy-1,3,6-pyrene trisulfonic acid）和共聚焦显微镜。在体外小鼠皮肤中绘制了天然pH梯度，发现角质层的pH值为6.4 ± 0.2，而真皮层的pH值接近中性，为7.1 ± 0.2。使用微针电极进行直流（DC）电穿孔时，阳极附近出现了显著的酸化现象。在150伏、100毫秒的脉冲作用下，pH值最大偏离了1.11个单位（pH 6.1 ± 0.1，p < 0.001），表明皮肤pH平衡受到了显著干扰。相比之下，使用双极交流（AC）正弦波脉冲可以防止这些pH变化，保持处理区域的生理pH梯度。结果表明，交流电穿孔可以减少电化学副作用，如pH值的扰动。本研究直接定量可视化了微针电穿孔引起的皮肤pH变化，并指出调整交流波形是缓解电穿孔相关pH改变的有效策略。
引言
皮肤表面的pH值对维持表皮稳态和屏障功能至关重要。角质层中的“酸性层”通常具有4到6的pH值，对多种生理过程至关重要，包括脂质代谢、角质细胞脱落的酶调控、抗菌防御以及微生物群的平衡[1][2]。这种表面酸性逐渐过渡到真皮层的接近中性pH值，形成了对皮肤健康至关重要的垂直pH梯度。这种梯度的破坏与多种皮肤病有关，如特应性皮炎、鱼鳞病、伤口愈合障碍和皮肤过早老化[2]。值得注意的是，表皮的通透性屏障稳态以及角质层的完整性和凝聚力直接受局部pH值调控[7]。因此，精确且深度分辨的皮肤pH动态评估对于基础皮肤病学研究和有效外用疗法的设计至关重要。
电穿孔是一种广泛使用的生物物理技术，通过脉冲电场暂时增加细胞膜通透性，从而实现DNA、RNA等化合物的细胞内递送，无需使用脂质纳米颗粒、病毒载体或其他复杂机制[8][9]。在皮肤应用中，电穿孔在增强药物和基因的经皮/真皮递送方面显示出巨大潜力，并已应用于电化学治疗、DNA疫苗和免疫调节等治疗模式[10][11][12][13]。
电穿孔过程中的表皮通透性和分子运输都是pH依赖性的[14]。虽然电穿孔的生理机制已得到广泛研究，但伴随的电化学过程——尤其是电极-组织界面的微环境变化——仍相对较少被探索[15][16][17]。这些反应主要由水电解和离子迁移驱动，可能导致pH值发生剧烈且局部的变化（通过质子H?和氢氧根离子OH?的积累）。这些变化可能影响药物稳定性、引起皮肤刺激并破坏组织稳态[15]。尽管具有临床意义，但电穿孔引起的皮肤组织内pH变化的时空动态尚未得到详细研究。
最近的电穿孔电极技术进展引入了微针阵列，作为传统平面电极的一种微创且定位精确的替代方案[18]。微针可以直接穿透角质层，将电脉冲传递到活表皮，从而减少疼痛和组织损伤[19][20]。然而，微针电极的封闭几何结构也可能将电场和电化学反应集中在微小区域，加剧局部生化扰动。因此，微针电穿孔对皮肤pH微环境的影响仍不清楚，这可能是限制此类技术合理设计和临床应用的关键瓶颈。
现有的pH测量方法（如平面玻璃电极或pH敏感条）仅限于表面评估，缺乏足够的空间和时间分辨率[21]。其他侵入性技术不适合实时监测电穿孔过程中皮肤各层的动态pH变化[22]。相比之下，结合比率荧光探针的共聚焦显微镜提供了一种强大的、无创的、深度分辨的成像方法，能够捕捉完整组织中的瞬态生化梯度[23][24][25]。这种方法有望高精度地可视化电穿孔引起的pH变化。荧光染料8-羟基-1,3,6-芘三磺酸三钠盐（HPTS）是一种成熟的比率pH指示剂，已被用于细胞、囊泡甚至某些活组织（如皮肤角质层）的pH测量[24][26]。然而，此前尚未有针对完整皮肤的深度分辨HPTS比率成像以及电穿孔引起的极性依赖性pH变化的定量研究。
在本研究中，我们使用高分辨率比率荧光成像平台与双光子激光扫描共聚焦显微镜相结合，定量监测微针辅助电穿孔过程中皮肤水微环境中的pH变化。在确定了体外皮肤的天然垂直pH梯度后，我们应用了常规直流脉冲，并研究了其对局部pH分布的影响。为了减轻电化学副作用，我们进一步探索了另一种电穿孔策略，即使用双极交流正弦波脉冲，这种脉冲也用于其他电刺激方法[27][28]及其他应用[29][30][31]。这种方法旨在减少电化学引起的pH扰动，从而提高安全性和有效性。我们的发现不仅提供了电穿孔引起的pH变化的定量可视化，还为优化皮肤病学和真皮应用中的电穿孔方案提供了理论依据。
材料
8-羟基-1,3,6-芘三磺酸（HPTS）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、蔗糖、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、含有磷酸二钠或磷酸二氢钠的磷酸盐缓冲液以及Pluronic F-127均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
动物和皮肤样本
BALB/c小鼠（8–12周龄）由Charles River Laboratories（马萨诸塞州威尔明顿）提供。所有动物实验均获得了乔治亚理工学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
比率pH探针HPTS的光谱特性
为了建立定量pH映射的基础，我们首先研究了荧光探针HPTS的pH依赖性光谱特性。HPTS适用于比率成像，因为它对pH变化的荧光响应一致且可预测。我们使用荧光光谱技术在pH范围3.90至10.19内系统评估了这一特性（图2）。
HPTS的激发光谱对其pH感应机制至关重要（图2a）。
结论
本研究采用比率荧光成像技术定量分析了微针电穿孔后皮肤的pH变化。该平台成功应用于正常皮肤内生理pH梯度的表征，并发现常规直流电穿孔会在阳极处引起剂量依赖性的酸化现象。为解决这一局限性，我们证明了使用双极交流正弦波脉冲可以减少pH扰动。
作者贡献声明
黄宇（Huan Yu）：撰写、审稿与编辑、实验设计。邓宁·夏（Dengning Xia）：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、监督、方法学设计、实验设计、资金获取、数据分析、概念构思。马克·R·普劳斯尼茨（Mark R Prausnitz）：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调。宋莉（Song Li）：撰写、审稿与编辑、实验设计。利益冲突声明
马克·R·普劳斯尼茨（MRP）是相关专利的发明人，并是一家开发电穿孔技术的公司的创始人/股东（该公司位于美国乔治亚州亚特兰大，专门从事该领域的研究）。相关利益冲突由乔治亚理工学院管理。作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。致谢
我们感谢Donna Bondy在行政上的支持。本研究得到了美国国立卫生研究院（R01AI143844）、比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1164271）、中国国家自然科学基金（82574348）以及深圳市科技创新计划（项目编号JCYJ20250604174800001）的支持。
邓宁·夏博士是中山大学的副教授，其研究领域涵盖药剂学、生物医学工程和转化药物递送系统。他的研究重点是基于微针的药物和疫苗递送、电穿孔及脉冲电场技术，应用于癌症治疗和皮肤病治疗。
