利用傅里叶变换红外光谱和化学计量建模技术快速检测家蚕（Bombyx mori）中的核多聚hedrovirus病毒

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Rapid detection of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus in silkworms using Fourier transform infrared spectroscopy and chemometric modelling

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）结合优化化学计量学方法实现家蚕核型多角体病毒（BmNPV）高效检测，通过840份血清样本分析，PLS-DA模型经一阶导数和均值中心化预处理后准确率达100%，并揭示感染阶段特异性代谢变化。

　　

张照辉|张叶顺|严慧

江苏省科技大学生物技术学院，镇江212100，中国

摘要

家蚕核多角体病毒（BmNPV）导致了蚕丝养殖业每年约70%的疾病损失，因此需要快速、准确且适用于田间的诊断方法。我们提出了一种结合傅里叶变换红外（FT-IR）光谱技术和分层化学计量学方法的早期BmNPV检测方案，该方案使用最少的血淋巴体积即可完成检测。在感染后五天内收集了840个样本进行分析。无监督主成分分析（PCA）显示不同感染阶段之间存在大量重叠，表明它们之间的区分度有限。线性判别分析（LDA）仍会出现误分类情况。经过基线校正和均值中心化处理后，k最近邻（kNN）算法的准确率达到99.29%，灵敏度和特异性均超过99%。使用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）并采用一阶导数和均值中心信号校正预处理的方法获得了最佳性能，在校准集和预测集中均实现了完美分类（灵敏度、特异性和准确率均为1.000）。值得注意的是，PLS-DA的潜在变量得分图（LV1：19.71%；LV2：23.44%）追踪了感染的时间进程，揭示了从早期能量动员到后期系统崩溃的阶段特异性代谢变化。这项研究表明，当FT-IR光谱技术与优化的化学计量学流程结合使用时，可以提供一个快速、低成本且高度准确的诊断平台，适用于实际的蚕丝养殖应用。通过实现早期检测和感染分期，该方法有助于及时干预、有效控制疾病并提高丝绸生产的可持续性。

引言

家蚕（Bombyx mori）在5000多年前就被驯化，至今仍是全球最具经济价值的昆虫之一。蚕丝养殖——即为生产丝绸而饲养家蚕——已在亚洲、非洲和拉丁美洲的许多国家发展成为一个重要的农业产业部门。虽然中国和印度合计占全球原始丝绸产量的大部分，但乌兹别克斯坦、巴西、泰国、越南和伊朗等国家也拥有庞大的蚕丝养殖产业，这些产业支持农村生计并贡献了国家出口收入[1]、[2]、[3]。

目前，蚕丝养殖业面临重大挑战，因为家蚕极易受到病毒感染，从而导致巨大的经济损失。其中，由家蚕核多角体病毒（BmNPV）引起的出血性败血症是最具破坏性和广泛传播的传染病，严重影响蚕丝生产[4]。这种感染具有高度传染性，且容易反复爆发，难以控制。据估计，每年该病毒造成的损失占蚕丝养殖相关损失的近70%。尽管进行了大量研究，但目前仍没有有效的预防或治疗策略[5]。 BmNPV感染是一个复杂的生物过程，主要通过消化道侵入家蚕体内。病毒首先感染中肠上皮细胞，随后扩散到脂肪体、丝腺和血细胞，导致全身性感染[6]。在此过程中，血淋巴会发生显著变化，包括出现病毒特异性蛋白质、上调抗菌肽和酚氧化酶等免疫相关蛋白质，以及蛋白质糖基化的改变，从而影响其结构构象。病毒复制还会扰乱宿主的新陈代谢。在核酸代谢方面，细胞裂解时释放出病毒DNA和RNA，同时增加细胞凋亡和坏死，使宿主核酸片段增多，并通过提高ATP和GTP的消耗刺激核苷酸合成。脂质代谢也发生变化，磷脂和胆固醇的比例发生变化，进而改变脂蛋白组成。在碳水化合物代谢中，剧烈的病毒复制会耗尽葡萄糖，破坏N-糖基化和O-糖基化，并改变糖蛋白谱型。这些代谢紊乱共同为检测病毒感染提供了依据[7]。 传统的BmNPV检测方法包括组织病理学检查、病毒分离与培养、光学显微镜和电子显微镜观察、聚合酶链反应（PCR）以及酶联免疫吸附测定（ELISA）[8]、[9]，目前仍是主要的诊断标准，但在大规模蚕丝养殖中的实际应用存在诸多限制。这些方法通常耗时较长，需要几小时到几周才能完成，且操作复杂、劳动密集，通量有限。此外，它们依赖于昂贵的仪器设备、常规维护和高度专业的人员，严重限制了其在田间条件下的适用性。因此，开发快速、高效、侵入性小且经济可行的替代分析方法已成为当务之急。 红外（IR）光谱技术利用红外区域的电磁辐射与物质的相互作用来探测分子的基本振动跃迁，从而提供关于各种物质（包括无机物、有机物、聚合物和生物材料）的详细化学和结构信息[10]、[11]。它在生命科学领域有广泛的应用。例如，Vanshika Adiani等人使用傅里叶变换红外（FT-IR）光谱技术评估了加工石榴籽的微生物质量，评估了总活菌数、酵母菌数和霉菌数等参数[12]。在另一项研究中，Sophia Johler等人应用FT-IR技术对70种金黄色葡萄球菌分离株进行了分析，分析了1200–800 cm^?1光谱范围内的细菌表面糖聚合物的变化。他们的结果显示，FT-IR分型方法的Simpson多样性指数为0.983，成功区分了49个亚型，其性能与金黄色葡萄球菌蛋白A分型（0.973）和脉冲场凝胶电泳（0.979）相当。该方法主要基于荚膜多糖类型（CP5、CP8、NT）来鉴定菌株，具有速度快、通量高和提供表型信息的优势，是金黄色葡萄球菌流行病学追踪和爆发分析的有效工具[13]。 为了解决传统BmNPV检测方法在工业蚕丝养殖中的技术局限性和实际应用障碍，本研究采用FT-IR光谱技术获取了家蚕的血淋巴光谱，实现了无需试剂的快速BmNPV感染诊断。FT-IR光谱技术具有多个优势：只需少量样本体积，无需化学试剂，并能在几分钟内得出结果[14]。此外，该技术操作简便、维护成本低、成本效益高，在不同环境条件下表现稳定——这些特性使其非常适合直接应用于实际蚕丝养殖环境[15]。

部分内容

家蚕

本研究中使用的实验模型是处于第三和第四龄期的家蚕幼虫。病毒BmNPV和家蚕P50均由中国农业科学院蚕业研究所提供。

家蚕中的BmNPV感染

制备了浓度为1×10⁸ VP/mL的BmNPV溶液，将桑叶浸泡在该溶液中1分钟。晾干后，将处理过的桑叶喂给家蚕。感染12小时后，使用正常桑叶

家蚕的感染过程

家蚕在食用被BmNPV污染的桑叶后，在感染初期（第1-2天）没有明显的外部变化。然而，在后期（第4-5天），由于病毒快速复制，出现了明显的生理恶化：血淋巴变为淡黄色，幼虫随后出现发病率和死亡率，如图2所示。

原始红外光谱

图3a展示了健康家蚕和BmNPV感染家蚕的原始红外光谱数据。

结论

本研究证明，将ATR-FT-MIR光谱技术与化学计量学结合使用，可以快速检测家蚕体内的BmNPV感染。采用Savitzky-Golay一阶导数结合标准正态变量（SNV）处理的统一预处理流程，有效消除了与感染无关的光谱变异。在评估的分类方法中，PLS-DA模型表现出最高的稳健性，实现了出色的区分准确性

CRediT作者贡献声明

张照辉：正式分析、研究、方法学设计、验证及撰写——原始草稿。张叶顺：资金获取。严慧：概念构思、正式分析、资金获取、方法学设计、监督、验证及撰写——审阅和编辑。

资助

本研究得到了中国农业研究系统专项基金（资助编号：CARS-18）和江苏省现代农业关键技术集成与推广项目（资助编号：JCTG[2025]21）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。