开发并评估一种用于检测家猫中弓形虫（Toxoplasma gondii）的反义PCR检测方法

《Veterinary Parasitology》：Development and evaluation of an antisense PCR assay for Toxoplasma gondii detection in domestic cats

本研究开发了一种靶向弓形虫B1基因的反义PCR检测方法，通过单管嵌套PCR技术有效抑制外层引物残留，灵敏度达0.1 pg/μL（较常规PCR提高10倍），特异性检测到无交叉反应，实验验证在33份感染猫血液样本中检测灵敏度为72.73%，显著优于常规PCR（Kappa=0.353，P<0.001）。

　　

李玉媛|白少媛|于海琼|傅丽志|朱家福|范世杰|潘明|何伟|黄思阳

中国江苏省扬州市扬州大学兽医学院比较医学研究所

摘要

作为Toxoplasma gondii的终末宿主，猫是人类弓形虫病传播的关键储存库。因此，快速准确地诊断猫的T. gondii感染对公共卫生至关重要。在这项研究中，我们开发了一种针对T. gondii B1基因的反义PCR检测方法。反义引物在单管嵌套PCR过程中有效抑制了残留外引物的活性。灵敏度分析表明，该方法的检测限为0.1 pg/μL的T. gondii DNA，比传统PCR方法（1 pg/μL）提高了10倍。特异性测试确认该方法不会与其他猫病原体发生交叉反应。使用33份实验感染的猫血液样本进行验证，反义PCR方法检测出24例阳性病例（72.73%，24/33），显著优于传统PCR方法（36.36%，12/33；Kappa = 0.353）。McNemar检验显示两者之间存在统计学上的显著差异（P < 0.001）。这种反义PCR方法具有高灵敏度、抗污染性和成本效益，适用于临床实验室的猫弓形虫病诊断。

引言

Toxoplasma gondii是一种属于顶复门（Apicomplexa）的专性细胞内寄生虫。作为一种机会性病原体，它几乎可以感染所有温血动物，导致弓形虫病（Sanchez和Besteiro，2021；Montoya，2024）。据估计，全球约有30-50%的人口感染了T. gondii（Deka等人，2021），其中非洲和大洋洲的感染率最高（Molan等人，2019）。最近的研究表明，普通人群中的感染率为8.20%，孕妇中的感染率为8.60%（Dong等人，2018；Li等人，2017）。猫在中国T. gondii的流行病学中起着关键作用，因为它们是负责排出环境抗性卵囊的终末宿主（Hatam-Nahavandi等人，2021）。过去50年的荟萃分析显示，家猫和野猫的T. gondii血清阳性率分别为约35%和59%（Montazeri等人，2020）。在中国，约有20.3%的猫被检测出T. gondii血清阳性（Xue等人，2021）。随着社会经济的发展，宠物猫和流浪猫的数量增加，人类感染T. gondii的风险也随之增加。然而，目前尚无针对猫或人类弓形虫病的有效疫苗或药物（Zhang等人，2022）。因此，开发一种高度特异性和灵敏度的T. gondii感染早期诊断方法对于控制弓形虫病的传播至关重要。

目前有多种方法可用于诊断弓形虫病，包括血清学检测和分子诊断方法。血清学检测通过检测针对T. gondii的特异性抗体来进行诊断（Yba?ez等人，2020），但检测窗口期较长，因此在T. gondii感染早期可能会出现假阴性结果（Liu等人，2015）。此外，不同试剂盒中使用的抗原差异也可能导致检测率不同（Zhang等人，2016）。

分子生物学检测方法具有高灵敏度。实时定量PCR（qPCR）具有高灵敏度，但成本较高且需要专门的实验室设备。环介导等温扩增（LAMP）的引物设计较为复杂，且该方法容易受到气溶胶污染，导致假阳性结果（Hardinge和Murray，2019）。PCR具有强大的分析灵敏度，甚至可以扩增单个基因拷贝（Yager等人，2008）。尽管PCR在疾病诊断中很受欢迎，但它也存在一些固有的缺点，例如由于物种间DNA高度相似性可能导致非特异性扩增，以及当目标病原体载量较低时检测灵敏度不足（Foo等人，2020）。嵌套PCR（nPCR）通过两轮扩增显著提高了灵敏度，但其操作需要逐步移液，容易导致交叉污染和假阳性，限制了其临床应用（Khlif等人，2009）。单管嵌套PCR（ST-nPCR）的发展部分解决了这一限制。然而，其灵敏度常常受到第二阶段残留外引物非特异性结合或试剂消耗的影响（da Silva等人，2013；Pontes等人，2014）。为了解决残留外引物的问题，之前的研究开发了一种针对内部转录间隔区1（ITS1）的ST-nPCR方法，通过减少外引物的用量来诊断由T. gondii引起的羊流产（Hurtado等人，2001）。然而，这种方法可能会影响第一阶段的扩增效率。为了克服这一限制并允许使用高浓度的外引物而不产生非特异性扩增，Brisco等人引入了“反义PCR”这一创新方法（Brisco等人，2011）。该方法使用与外引物互补的反义引物，在单管反应中进行检测。通过在5'和3'末端引入错配序列，这些反义引物在第二阶段特异性地与残留的外引物结合，从而防止它们与目标序列结合。反义PCR已成功用于检测多种病原体，包括Chlamydia abortus（Shatleh-Rantisi等人，2020）、白斑综合征病毒（WSSV）（Park等人，2013）和Clostridium botulinum（Jang等人，2015）。然而，反义PCR尚未应用于T. gondii的检测。在这里，我们开发了一种针对家猫血液样本中T. gondii DNA（以速殖体阶段为目标）的高灵敏度检测方法。

伦理声明

本研究得到了中国江苏省扬州市扬州大学动物管理和伦理委员会的批准。所有动物的处理均严格遵循中华人民共和国的动物伦理程序和指南。

样本收集和DNA提取

将3只猫口服感染300个T. gondii PRU菌株的囊囊，这些菌株来自小鼠。从感染后的第一天开始，每隔一段时间收集这些猫的血液样本，持续整个第一个月。

反义PCR的优化

成功优化了用于T. gondii

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