《Virology》：Experimental validation of compound 3md, identified
in silico, demonstrates antiviral effect on DENV2 by intervention in the replicative phase.
编辑推荐：
登革热病毒（DENV）感染机制复杂，现有研究通过计算模型筛选出具有抗病毒潜力的化合物。实验验证发现化合物3md可显著降低DENV2病毒产量约3个对数单位（PFU/mL），其作用机制可能涉及干扰病毒RNA复制及蛋白表达过程，具体通过抑制病毒基因组复制和蛋白加工实现。本研究整合计算预测与体外实验，为开发新型抗登革药物提供依据。
Leidy L. García-Ariza|Leonardo Padilla-Sanabria|Mariano A. García-Blanco|Jhon C. Casta?o-Osorio
分子免疫学小组，生物医学研究中心，昆迪奥大学健康科学学院，哥伦比亚亚美尼亚
摘要
登革热是一种主要影响热带和亚热带国家人群的病毒性传染病，由正黄病毒属（orthoflavivirus）中的登革热病毒（dengue virus）引起。目前尚无特定的治疗方法来降低病毒载量；因此，继续评估潜在的抗病毒药物非常重要。在本研究中，通过计算机模拟（in silico）实验验证了先前发现的化合物，评估了它们对病毒周期的影响。测试了10种化合物对病毒斑块形成单位（plaque-forming unit）的抑制作用，发现化合物3md可将感染性病毒的产生量减少约3个对数单位（log10 PFU/mL）。此外，它通过干扰蛋白质的复制和/或表达来减少感染细胞的比例，从而降低DENV2病毒的RNA合成。这些发现表明，3md的作用机制主要与其对病毒基因组复制的干扰有关。
引言
登革热是由登革热病毒（DENV）引起的，该病毒通过受感染的雌性Aedes aegypti和Aedes albopictus蚊子叮咬传播（Yi等人，2023年）。世界卫生组织（WHO）估计，每年有1亿人感染登革热，其中50万人需要住院治疗，约2.5万例导致死亡（Hossain等人，2025年）。过去50年来，全球登革热发病率增加了30倍，估计有40%的人口面临感染风险（Bai等人，2025年）。其流行率上升的原因包括全球旅行增加、城市化以及病媒控制不足（Zong等人，2025年）。
登革热病毒是一种具有二十面体对称性的有包膜病毒，其基因组为正链单链（ssRNA），长度约为11千碱基对（Anumanthan, Sahay和Mergia，2025年），编码10种蛋白质，包括3种结构蛋白和7种非结构蛋白（Choubey等人，2020年）。登革热病毒有4个血清型，即DENV-1、2、3和4，这些血清型之间的序列保守度高达65%（Rashmi等人，2024年）。
DENV感染始于病毒与宿主细胞受体的结合。随后病毒通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞（根据细胞类型的不同，也可能存在其他内吞机制），内体中的低pH值触发内吞膜与病毒包膜的融合，使核衣壳释放到细胞质中（Troost和Smit，2020年）。核衣壳的解体使得病毒RNA在细胞质中组装（Sinha等人，2024年）。病毒RNA在内质网（ER）中作为翻译和复制的模板（Nanaware等人，2021年）。病毒基因组被翻译成一个多聚蛋白，该多聚蛋白被宿主和病毒蛋白酶（NS3）切割成三种结构蛋白：衣壳蛋白（C）、前膜蛋白或膜蛋白（prM/M）和包膜蛋白（E），以及七种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）（Ulgheri、Bernardes和Lancellotti，2025年）。这三种结构蛋白具有明确的功能。DENV衣壳蛋白主要通过在其组装过程中聚集病毒RNA来保护病毒基因组，并在感染过程中促进基因组的释放。结构包膜蛋白（E）和前膜蛋白（prM）被转运到内质网（ER）（Troost和Smit，2020年）。DENV的非结构蛋白参与病毒复制和传播，尽管它们各自具有不同的功能（Ulgheri、Bernardes和Lancellotti，2025年），包括产生正链和负链单链RNA拷贝（Kato等人，2016年）。当病毒蛋白的翻译足够多时，基因组会在内质网膜上形成凹陷结构（RO），即病毒基因组复制的场所。在RO内，基因组复制首先合成负链复制中间体，随后合成正链基因组RNA。NS3蛋白具有蛋白酶、解旋酶和核苷酸三磷酸酶活性，而NS5蛋白具有依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp）和甲基转移酶（MTase）活性，这两种蛋白共同完成了病毒RNA复制和新合成正链RNA的保护所需的所有酶促反应。基因组复制完成后，新合成的正链基因组RNA从RO中释放出来，可以进一步翻译或被运输到组装部位包装成子代病毒颗粒（Abram等人，2024年）。未成熟的病毒颗粒被运输到反式高尔基网络，在那里酸化作用导致其构象变化，随后暴露于蛋白酶furin的作用下形成成熟的病毒颗粒（Sinha等人，2024年）。最终，完全成熟的传染性登革热病毒颗粒被释放到细胞外空间，准备感染新的宿主细胞（Ghosh等人，2025年）。
在登革热病毒蛋白中，NS5是最大且保守性最强的蛋白，在四种登革热血清型中序列相似度约为70%（Ulgheri、Bernardes和Lancellotti，2025年），含有约900个氨基酸，分子量接近100 kDa（Hossain等人，2025年）。NS5具有两种主要功能：位于C端的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）活性，对病毒复制至关重要；以及位于N端的RNA甲基转移酶（MTase）活性，该活性在多聚蛋白翻译过程中对RNA加帽至关重要（Ulgheri、Bernardes和Lancellotti，2025年）。这两种功能对病毒复制都至关重要（Ahmadi、Jahantigh和Ahmadi，2025年）；此外，正黄病毒属的NS5已知能与5’和3’非翻译区的结构元素相互作用，促进病毒RNA合成（Obi、Kihn和McQueen，2025年），这使得NS5成为了一个有价值的抗病毒靶点（Hossain等人，2025年）。
登革热的治疗主要基于支持性疗法，因为缺乏特定的抗病毒药物（Zong等人，2025年）。尽管已经付出了大量努力寻找针对DENV的抗病毒化合物，但取得的成功有限，因此目前尚无有效的获批抗病毒药物（Bai等人，2025年；Hossain等人，2025年）；因此，寻找具有低毒性或无毒性且具有强抗登革热活性的新替代方案变得必要。
在之前的研究中，发现了18种具有药物特性的化合物，并通过计算机模拟证实了它们与NS5的相互作用，其中10种化合物在体外实验中显示出对抗DENV的潜力（García-Ariza等人，2022年）（表1）。为了继续对这些化合物进行实验验证，从而识别出可能用于未来DENV治疗的候选分子，本研究评估了这些化合物以及3md对病毒复制周期不同阶段的影响。值得注意的是，我们发现化合物3md通过干扰病毒基因组的复制阶段来降低感染细胞的比例，这干扰了蛋白质合成并减少了感染性DENV2病毒颗粒的产生。
部分内容
细胞系和病毒
使用了以下细胞系：Huh-7人肝癌细胞（ATCC? HB 8065）、C6/36蚊子细胞（ATCC? CRL-1660）、BHK-21仓鼠肾细胞（ATCC? CCL-10?）以及携带DENV-2亚基因组复制子的Huh-7 Rep DENV2细胞（Huh-7细胞系）。这些细胞系由美国加尔维斯顿UTMB的生物化学与分子生物学系提供。Huh-7细胞在DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基，参考编号25-500，Gen Clone）中培养，C6/36细胞在L-15培养基中培养。
这些化合物不会影响Huh-7细胞的存活能力
根据24小时MTT细胞毒性试验的结果，在最高测试浓度（50 μM）下，这些化合物对Huh-7细胞没有表现出细胞毒性效应，存活率接近100%，表明该细胞系的CC50 > 50 μM。在48小时时，大多数化合物处理后细胞存活率有所下降，其中3md处理的细胞存活率下降了约50%，与对照组相比具有统计学上的显著差异（p < 0.05），而6sd处理的细胞存活率仍保持在100%左右。
讨论
近年来，人们一直在努力寻找有效的抗病毒化合物来治疗登革热。在已发现的化合物中，只有少数在临床或临床前试验中得到了进一步评估（Troost和Smit，2020年）。寻找有效治疗方法的困难在于一些化合物的毒性（Fusco和Chung，2014年；Lim等人，2015年；García、Padilla和Casta?o，2017年）；因此，这一点非常重要
结论
本研究通过结合计算机模拟和体外方法，对具有抗DENV潜力的化合物进行了评估。我们描述了一种新型化合物3md的抗病毒活性，其EC50值为3.63 μM，选择性指数约为13.75。基于实验结果，3md可能干扰病毒RNA复制和/或病毒蛋白加工，因为基因组拷贝数量减少，从而改变了病毒的行为。
CRediT作者贡献声明
Leonardo Padilla-Sanabria：撰写——审稿与编辑、验证、监督、项目管理、方法学研究、资金获取、概念构思。Leidy Lorena García-Ariza：撰写——初稿撰写、方法学研究、资金获取、数据分析、数据管理、概念构思。Jhon Carlos Casta?o-Osorio：撰写——审稿与编辑、验证、监督、项目管理、方法学研究、资金获取、概念构思。Mariano García-Blanco：撰写
未引用的参考文献
Ahmadi等人，2025年；Anumanthan等人，2025年；Cannalire等人，2020年；Cannalire等人，2018年；Ehrt等人，2019年；Gilberg等人，2019年；Hammoudeh等人，2009年；Haupt等人，2013年；Hernández-Castro等人，2015年；Lee等人，2023年；Ludlow等人，2015年；Obi等人，2025年；Ulgheri等人，2025年；Van den Elsen等人，2021年；Zong等人，2023年。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢：
作者LLG-A、LP-S和JCC-O感谢MAG-B在德克萨斯大学医学分校（UTMB）实验开发工作中的支持。
