《Journal of Experimental Pharmacology》：Cytotoxicity and Coagulation Effects of Methanolic Extracts of Punica granatum, Quercus infectoria, and Achillea millefolium: an in vitro Study
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本文通过体外研究，比较了石榴花 (Punica granatum)、没食子栎瘿 (Quercus infectoria) 和欧蓍草地上部分 (Achillea millefolium) 的甲醇提取物对人体凝血功能的影响。研究发现，石榴提取物显著缩短凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（aPTT），表现促凝作用；没食子栎提取物则显著延长上述时间，呈抗凝作用；而欧蓍草提取物未显示显著影响。研究为这些传统止血植物的临床应用提供了初步科学依据。
引言：探寻传统止血植物的科学依据
在医学不断进步的今天，失血性休克依然是创伤、分娩及战场上的首要致死原因。尽管机体自身拥有启动止血和控制出血的自动机制，但持续出血仍会危及生命。局部应用的止血药物在实现止血方面具有广泛的临床应用价值，该过程涉及血管收缩、凝血级联反应的激活及血液凝固等多个连续步骤。药用植物及其成分的止血潜力早已为人所知，并可能在预防出血致死方面发挥关键作用。
本研究基于波斯传统医学（PMT）的记载，选取了三种药用植物：欧蓍草 (Achillea millefolium)、石榴 (Punica granatumL.) 和没食子栎 (Quercus infectoria)。欧蓍草在传统上用于治疗消化系统相关疾病，多项研究显示其在减少大鼠和人体内器官出血方面有效。石榴花（Golnar）在波斯传统医学中因其止血和收敛特性而闻名，富含可水解单宁（特别是安石榴苷和鞣花酸衍生物），这些物质是强大的蛋白质沉淀剂，已知能使血液蛋白变性并促进血小板聚集。没食子栎瘿富含单宁（特别是没食子单宁和没食子酸）和酚酸，因此具有收敛、抗炎和止血特性。这三种植物均含有高水平的酚类化合物，其中单宁尤为丰富。研究表明，单宁作为植物源化合物，可以影响血小板功能、血液凝固、纤溶系统和内皮活性，同时也表现出抗血栓特性。
考虑到这三种植物的历史应用以及现有实验研究结果的多样性，本研究旨在比较评估源自这三种药用植物的甲醇提取物对体外凝血时间的影响。甲醇提取物能够萃取出比水提物更广谱的生物活性成分（包括类黄酮和萜类化合物），这些成分参与血小板聚集和止血等药理机制。在评估生物活性之前，必须进行细胞毒性筛选以确定既具有生物活性又对人体细胞安全的浓度，确保观察到的凝血效应不受一般细胞毒性的干扰。
材料与方法：从提取到检测的系统流程
植物材料收集与提取物制备
没食子栎瘿采集自克尔曼沙赫，欧蓍草叶购自市场，石榴花由专业草药师鉴定。每种植物材料各取约500克，采用浸渍法分别制备70%甲醇提取物。提取物通过旋转蒸发仪浓缩，在40°C烘箱中完全干燥，并储存于-20°C待测。
总酚含量（TPC）、总黄酮（TF）与总单宁含量（TTC）测定
使用Folin-Ciocalteu法测定TPC，结果以毫克没食子酸当量/克干提取物表示。采用氯化铝比色法测定TFC，结果以毫克芦丁当量/克干提取物表示。使用香草醛-甲醇法测定TTC，结果以毫克儿茶素当量/克干提取物表示。
细胞毒性试验
通过MTT比色法评估三种提取物对NIH/3T3细胞系的细胞毒性活性。将细胞暴露于不同浓度的提取物中48小时，然后加入MTT溶液，孵育3小时后用DMSO溶解甲臜晶体，读取490 nm处的吸光度以测定细胞活力。
血浆制备
从四名健康成年志愿者采集血样，与枸橼酸钠混合，以2500 g离心10-15分钟，分离出的血浆冷藏备用。
凝血酶原时间（PT）与活化部分凝血活酶时间（aPTT）测定
PT测定中，将预热好的PT试剂与患者血浆（或正常盐水对照）以及特定浓度的植物提取物（石榴4%，没食子栎0.001%，欧蓍草2%）混合，记录凝块形成所需时间。aPTT测定过程类似，先将aPTT试剂与血浆及提取物混合孵育，再加入氯化钙（CaCl2）溶液启动计时，记录凝块形成时间。
结果：成分差异与凝血效应的鲜明对比
植物提取物得率
Q. infectoria、A. millefolium和 P. granatum的提取物得率分别为25.2%、12.2% 和 35.8%。
总酚、总单宁与总黄酮含量
在分析的样本中，Q. infectoria的TPC最高（287.18 ± 4.12 mg 没食子酸当量/g干提取物），其次是 P. granatum（60.51 ± 2.26 mg/g）和 A. millefolium（7.59 ± 0.62 mg/g）。P. granatum的单宁含量最高（119.21 mg 儿茶素当量/g干提取物），其次是 Q. infectoria（109.30 mg/g）和 A. millefolium（54.35 mg/g）。总黄酮含量最高的是 P. granatum（98 mg 芦丁当量/g），其次是 A. millefolium（85.5 mg/g）和 Q. infectoria（5.22 mg/g）。
细胞毒性试验结果
石榴、欧蓍草和没食子栎的半数抑制浓度（IC50）分别为18.6%、3.3%和13.3%。选择对细胞无明显毒性的浓度进行凝血实验：石榴4%，没食子栎0.001%，欧蓍草2%。
体外凝血酶原时间（PT）
根据植物基凝血测试，石榴提取物显著缩短PT至11.57?±?0.37秒，而对照组为14.47?±?0.41秒。相反，没食子栎提取物显著延长凝血时间至17.07?±?1.07秒。欧蓍草提取物未引起PT的显著变化。
体外活化部分凝血活酶时间（aPTT）
石榴提取物显著降低aPTT至33.83 ± 0.79秒，对照组为36.30 ± 2.04秒。没食子栎提取物则显著延长aPTT至50.00?±?2.04秒。欧蓍草提取物同样未对aPTT产生显著影响。
讨论：传统认知与现代发现的交汇与分歧
本研究评估了三种植物甲醇提取物对人血凝血指标PT和aPTT的体外影响。结果表明，这些提取物对凝血具有差异化的调节作用：P. granatum表现出促凝活性，Q. infectoria显示出抗凝效应，而 A. millefolium在测试浓度下对PT或aPTT无显著影响。
TPC分析结果与先前关于这些植物富含多酚类成分的报告一致。在凝血试验中，P. granatum提取物显著缩短PT和aPTT，表明其可能通过增强外源性和内源性途径产生促凝作用。这与先前的研究相符，即石榴提取物通过多酚与纤维蛋白原和凝血酶的相互作用减少凝血时间并抑制血小板聚集。相反，Q. infectoria提取物延长了PT和aPTT，表现出抗凝活性。这与关于甲醇植物提取物通过干扰因子激活来增加PT和aPTT的报告一致。然而，这与 Q. infectoria用于止血的传统用途形成对比，传统上其局部应用可促进伤口愈合而无全身性抗凝作用。
欧蓍草提取物在2%浓度下未引起PT或aPTT的显著变化，这可能表明其在体外对全身凝血具有中性影响，尽管传统上声称其具有止血特性。这可能是因为其类黄酮诱导的局部血管收缩，而非直接调节凝血因子。
石榴花由于含有高含量的单宁和类黄酮化合物，显示出更强的促凝效果，表明这些化合物可能在其中发挥了作用。而 Q. infectoria强烈的抗凝活性可能归因于其独特的多酚组成，可能会干扰钙等关键凝血因子，而不是促进蛋白质沉淀。尽管两者都富含单宁，但与石榴的鲜明对比凸显了单宁类型和作用机制的重要性。
本研究的局限性包括其体外性质，可能无法反映体内药代动力学或与血小板等全血成分的相互作用。仅使用四名志愿者的血浆引入了变异性，并且对单一物种（来自伊朗东南部）的关注由于植物化学型的遗传和环境差异而限制了普遍性。未来的研究应纳入体内模型、血小板聚集试验和分子对接研究以阐明机制，同时针对月经过多或术后出血等病症进行临床试验。
结论与展望
总而言之，P. granatum的甲醇提取物显示出作为促凝剂的前景，而 Q. infectoria则起到抗凝剂的作用，A. millefolium在此背景下保持中性。这些发现表明有必要进一步研究这些植物用于止血治疗，并指出需要鉴定其主要成分并随后标准化提取物。石榴强烈的促凝活性与其异常高的单宁含量完全吻合，单宁是一类已知能使纤维蛋白原沉淀并促进凝血的化合物。相反，没食子栎尽管酚类含量高，却具有强烈的抗凝作用，这表明了不同的机制，可能是通过螯合必需的钙离子或其特定的单宁谱抑制关键的凝血酶。
研究团队承认，纳入阳性对照（如用于PT测定的华法林化血浆或用于aPTT测定的肝素化血浆）本可以加强实验验证。在当前研究中省略这些是一个局限性。本研究使用四名健康捐赠者的血液进行初步体外筛选，该样本量旨在允许对提取物活性进行配对的、概念验证性的评估，同时承认在检测小效应方面的统计效力存在局限性。
该研究获得了克尔曼沙赫医科大学伦理委员会的批准，所有参与者均提供了书面知情同意书。作者声明本研究符合《赫尔辛基宣言》，且声明无竞争利益。
