《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Changing genetic profiles of Plasmodium falciparum piperaquine resistance in Southeast Asia over 25 years
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这篇综述系统性追踪了过去25年东南亚恶性疟原虫对哌喹（PPQ）耐药性的遗传演变。文章核心揭示了耐药性与P. falciparum氯喹耐药转运蛋白（pfcrt）基因的突变以及P. falciparum疟原虫蛋白酶2/3（pfplasmepsin2/3）基因扩增之间的强关联。通过分析跨越国界和时间的大量样本，研究强调了持续进行遗传监测对于维持以青蒿素为基础的联合疗法（ACT）疗效、指导区域抗疟策略的重要意义。
引言
疟疾仍是全球主要的公共卫生问题，有效的治疗是消除疟疾努力的关键。历史上，氯喽在20世纪的疟疾治疗中扮演了核心角色。然而，恶性疟原虫对氯喹的耐药性最早于20世纪50年代末在东南亚被发现，随后在70年代末传播到非洲。对哌喹单药治疗的耐药性出现在20世纪80年代，随后在2008年出现了对青蒿素衍生物单药的耐药性。目前，双氢青蒿素-哌喹被世界卫生组织推荐为治疗无并发症恶性疟的一线疗法。然而，柬埔寨（2008-2010年）、越南（2015年）以及近年泰国东北部（2015-2018年）相继报告了双氢青蒿素-哌喹治疗失败。相比之下，在缅甸的三个研究点，两种青蒿素联合疗法——蒿甲醚-本芴醇和双氢青蒿素-哌喹——仍保持较高的治疗效果。
恶性疟原虫氯喹耐药转运蛋白基因编码一个424个氨基酸的蛋白质，具有10个预测的跨膜结构域，定位于消化泡膜。pfcrt基因变体包含4到10个非同义突变，其中K76T替换在赋予氯喹耐药性中起核心作用。该替换去除了PfCRT蛋白一个预测底物结合位点的正电荷，允许质子化的氯喽沿着其电化学梯度离开消化泡。此外，新的氨基酸替换——T93S、H97L、H97Y、F145I、I218F、M343I、M343L、C350R、G353V和G367C——已被证实与哌喹耐药性相关。
pfcrt突变的全球分布已被广泛记录。两种主要的耐药单倍型C72-V73-M74I-N75E-K76T和C72S-V73-M74I-N75E-K76T被广泛观察到。C72-V73-M74I-N75E-K76T单倍型在东南亚和非洲占主导地位，而C72S-V73-M74I-N75E-K76T单倍型更多见于南美洲、巴布亚新几内亚和菲律宾。相比之下，氯喹敏感菌株携带野生型C72-V73-M74-N75-K76单倍型。多项研究报告了pfcrt突变流行率的变化。例如，随着非洲氯喹使用压力的撤除，耐药性pfcrt等位基因数量出现下降。此外，与哌喹耐药相关的pfcrt点突变报告日益增多。在柬埔寨，pfcrt突变在2012-2013年几乎不存在，但到2016年，95%的分离株携带此类突变。最初，M343L和G353V是最常见的变体，到2016年，G353V成为主要变体，存在于57%的分离株中。在南美洲，哌喹耐药标记C350R高度流行，在2016至2018年间，苏里南83%和圭亚那73%的分离株中均观察到。实验室研究证实，携带C350R突变的寄生虫在哌喹存活试验中存活率超过10%，而携带野生型等位基因的分离株对哌喹敏感。最近的遗传杂交研究进一步证实了pfcrt在哌喹耐药中的作用，确定G367C突变是直接贡献者。与之前描述的、影响转运蛋白中央腔的哌喹相关突变不同，G367C位于跨膜结构域9面向消化泡的一侧。然而，该突变在东南亚的流行率仍然很低。
在非洲，这些新的pfcrt突变尚未在野外分离株中广泛检测到。尽管如此，基因编辑实验表明，F145I突变可以在非洲寄生虫菌株（来自加蓬的GB4）中赋予中度的哌喹耐药性。除了pfcrt突变外，疟原虫蛋白酶2基因的扩增也与柬埔寨的哌喹耐药性相关。因此，pfplasmepsin2扩增被提议作为追踪哌喹耐药性的分子标记。尽管体外证据相当令人信服地表明某些pfcrt突变能赋予耐药性，但由于实验的技术问题，这一点尚未在plasmepsin2扩增中得到明确证明。重要的是，驱动该地区近期恶性疟原虫进化的主要选择压力是与K13突变相关的青蒿素耐药性。由于青蒿素联合疗法依赖于青蒿素成分，K13介导的耐药性通常在大范围伴侣药物（如哌喹）耐药发展之前出现。
本研究旨在评估从柬埔寨、泰国、老挝、越南和缅甸收集的恶性疟原虫分离株中与哌喹耐药相关的遗传标记的流行率和模式。具体而言，研究分析了pfcrt基因在密码子T93S、H97L、H97Y、F145I、I218F、M343I、G353V和G367C的突变，以及pfplasmepsin2基因的扩增。此外，研究还考察了这些标记的时空分布、它们与各国抗疟药物政策的关联，以及pfcrt突变和pfplasmepsin2扩增之间的关系。最后，对pfcrt基因座周围的微卫星进行了分析，以检测选择性清除的证据，从而深入了解耐药寄生虫种群的进化动态。通过呈现来自东南亚的全面遗传数据，本研究旨在促进对疟疾药物耐药性进化的更深入理解，并为该地区正在进行的疟疾消除工作提供信息。
材料与方法
标本收集
在1995年至2023年间，从柬埔寨、泰国、老挝、越南和缅甸的17个研究点共收集了898份标本。具体而言，从柬埔寨的马德望、拜林、菩萨、腊塔纳基里和上丁获得了401份样本；从老挝的阿速坡、占巴塞、沙拉湾、沙湾拿吉和色贡获得了232份样本；从缅甸的克伦邦获得了56份样本；从泰国的四色菊、达府、乌汶和也拉获得了107份样本；从越南的平福和庆和获得了102份样本。
DNA提取与分子分析
使用商业DNA提取试剂盒从确诊为恶性疟原虫感染的患者标本中提取DNA。通过巢式聚合酶链反应扩增pfcrt基因，条件如前所述。通过桑格测序鉴定pfcrt基因中的突变。根据既定方案，通过实时PCR评估pfplasmepsin2基因的扩增情况。
使用一组位于7号染色体上大约-279kb至468kb之间的微卫星标记分析pfcrt基因周围的遗传多样性。每个微卫星通过巢式PCR使用特定的引物组进行两轮扩增。第一轮使用含DNA模板的反应体系，循环条件包括30个循环，退火温度为50°C。第二轮使用不同的反应体系和退火温度条件。
结果
与哌喹耐药相关的pfcrt突变流行率
在分析的898份样本中，鉴定出与哌喹耐药相关的pfcrt突变如下。在西柬埔寨的拜林，2007-2008年仅检测到野生型pfcrt。突变首次出现在2011年，八分之一（12.5%）的分离株分别携带I218F、M343L和G353V突变。到2015-2017年，在30个分离株中鉴定出突变，包括T93S、H97Y、I218F、M343I和G353V。T93S在2015年（n = 11）、2016年（n = 15）和2017年（n = 4）的流行率分别为9%、6%和50%。H97Y在2015年（n = 11）和2017年（n = 4）分别观察到18%和25%，而G353V在2015年（n = 11）达到峰值18%。I218F和M343I突变在2015年（n = 11）各占9%。在此之后，由于恶性疟原虫病例显著减少，2017年后未再从拜林获得样本。在西柬埔寨的菩萨，由于没有更早的样本可用，观察到高度的突变多样性，特别是在2019年，H97Y最为突出（44.4%；n = 72）。H97L突变于2019年首次观察到（19.4%；n = 72），同时还有F145I、I218F、G353V和M343I突变。在柬埔寨东北部的上丁，2018年（n = 95）和2019年（n = 84）分别发现T93S突变流行率为14%和12%，同时还存在H97Y、F145I、I218F和M343I突变。在柬埔寨的马德望和腊塔纳基里，G353V突变在马德望的流行率为2015年43%（n = 7）和2016年91%（n = 11），而腊塔纳基里则显示出多样的突变，包括2016年25%的F145I（n = 12），2017年38%的T93S和38%的I218F（n = 8），以及2018年33%的H97Y和17%的T93S（n = 6）。在老挝的占巴塞，2018年（n = 30）检测到T93S突变流行率为30%，同时还有7%的F145I和3%的I218F突变。在老挝的阿速坡，直到2018年T93S和H97Y突变出现之前，一直仅观察到野生型等位基因。在老挝的沙拉湾和色贡，大多数分离株保持野生型，尽管在2013-2014年检测到一些H97L突变。在老挝的沙湾拿吉，2003年、2010年、2013年和2014年收集的所有分离株均为野生型。在泰国的四色菊，2015-2017年观察到多样的突变谱，F145I、I218F和G353V各约占25%。在泰国的乌汶，T93S突变在后期变得突出，2018年（n = 8）流行率达到63%，同时还有12.5%的F145I和25%的G353V。在泰国的达府，1995年（n = 10）鉴定出早期突变，包括40%的I218F和10%的G353V，随后在2013-2016年（n = 34）未再观察到。在缅甸的克伦邦，2015年至2023年收集的所有分离株（n = 56）保持野生型。在越南的平福，发生了从2011-2012年主要为野生型寄生虫到2016-2019年多样突变谱的转变。2016年，I218F突变占主导，在13个分离株中的38%中发现。2017年，14个分离株中的57%携带T93S突变。2018年（n = 17），29%具有T93S突变，与F145I的流行率相同，而到了2019年，F145I成为最流行的突变，在22个分离株中的50%中检测到。此外，使用桑格测序法对898份样本中的124份（14%）进行了pfcrt基因外显子11中G367C突变的筛查，包括来自柬埔寨（2011-2017；n = 58）、泰国（2015-2018；n = 27）和越南（2016-2017；n = 6）的样本。所有样本均被确定为野生型。
pfplasmepsin2基因扩增
共分析了851份样本的pfplasmepsin2基因拷贝数变异。样本收集自柬埔寨（n = 385；2007–2008，2011–2012，2015–2020）、老挝（n = 231；2003，2010–2011，2013–2014，2017–2018）、泰国（n = 93；1995，2013–2018）、越南（n = 101；2011–2012，2016–2019）和缅甸（n = 41；2015，2017，和2023）的多个年份。
来自柬埔寨的寄生虫分离株表现出最高的最大相对定量值3.21，表明其pfplasmepsin2基因拷贝数最高。越南的第二高RQ值为2.82，而泰国的最低最大RQ值为2.55。
在柬埔寨的样本中，45.97%检测到pfplasmepsin2基因的多拷贝，在老挝的样本中为4.76%。在西柬埔寨，包括菩萨、马德望和拜林，62.78%的样本中发现pfplasmepsin2基因多拷贝，而在柬埔寨其他地区为31.22%。在泰国，乌汶（68.81%）和四色菊（82.61%）这两个靠近柬埔寨边境的地区观察到多拷贝的高流行率。相反，在达府（泰国西部）和也拉（泰国南部），未检测到携带pfplasmepsin2多拷贝的分离株。
在越南的平福，2011-2012年没有寄生虫携带多拷贝；然而，到2016-2019年，71.21%的寄生虫表现出pfplasmepsin2基因多拷贝。
pfcrt突变与pfplasmepsin2基因扩增之间的关联
共有851份样本成功分析了pfplasmepsin2 CNV和与哌喹耐药相关的pfcrt突变。结果表明，超过75%携带pfcrt突变（H97Y、I218F、M343I、M343L和G353V）的寄生虫携带pfplasmepsin2的多拷贝，而携带T93S、H97L和F145I的寄生虫中，有22%–54%携带pfplasmepsin2的多拷贝。在柬埔寨，携带pfcrt突变的分离株比例约为41%，而观察到pfplasmepsin2多拷贝的约为46%，两种标记共存的为27%。在老挝人民民主共和国，流行率要低得多，pfcrt突变为12%，pfplasmepsin2多拷贝为5%，共存为3%。在缅甸，仅观察到pfplasmepsin2多拷贝，为39%。在泰国，43%的分离株存在pfcrt突变，36%存在pfplasmepsin2多拷贝，31%同时存在两种标记。在越南，流行率最高，pfcrt突变为59%，pfplasmepsin2多拷贝为50%，两种标记共存为44%。
在柬埔寨的拜林，观察到多种pfcrt突变，常与pfplasmepsin2多拷贝相关。在菩萨，注意到H97Y突变的高流行率，通常与pfplasmepsin2多拷贝相关。在越南的平福，观察到从2011-2012年主要为野生型pfcrt和单拷贝pfplasmepsin2，转变为到2019年出现多样pfcrt突变，特别是F145I，并与pfplasmepsin2多拷贝相结合。在泰国的四色菊和乌汶，自2015年起记录到pfcrt突变和pfplasmepsin2多拷贝的增加。在老挝和缅甸，通常维持野生型pfcrt和单拷贝pfplasmepsin2，少数例外。
时间分析揭示了柬埔寨、越南和泰国pfcrt突变和pfplasmepsin2 CNV的不同模式。在柬埔寨（2007-2019年），pfplasmepsin2 CNV最初作为哌喹耐药的主要标记出现，在2015年达到88%的流行率峰值。随后，新的pfcrt突变，特别是H97Y和G353V出现。H97Y的流行率自2008年起急剧增加，在2017年左右达到约50%的峰值，然后在2018-2019年显著下降，这与柬埔寨从双氢青蒿素-哌喹改为青蒿琥酯-甲氟喹的政策变化时间吻合。pfplasmepsin2 CNV的流行率同样在2018-2019年下降到33%-38%。
越南表现出类似的趋势，pfcrt突变和pfplasmepsin2 CNV在2012年后迅速出现，到2017年分别达到约93%和100%的峰值频率。各种pfcrt点突变显示出不同的时间模式，其中T93S最为流行。其他标记如H97Y、F145I、I218F和M343I的频率保持在40%以下。
在泰国东部（2015-2018年），pfcrt突变流行率从约65%急剧增加到近100%。pfplasmepsin2多拷贝始终保持较高水平（约75%-80%）。值得注意的是，I218F从约45%大幅下降到几乎为零，而G353V最初增加但稳定在30%左右。不太流行的突变（H97L、H97Y和F145I）波动较小，一般保持在15%以下。T93S出现较晚，到2018年呈增长趋势。
这些发现突显了药物耐药性遗传标记动态的进化格局，可能反映了抗疟药物使用带来的选择压力。
微卫星标记分析
使用一组跨越7号染色体总共748.403 kb的微卫星标记评估了pfcrt基因周围的遗传多样性。来自柬埔寨腊塔纳基里（2011年）携带CVMNK单倍型的P. falciparum寄生虫分离株对照样本，在整个检查区域内表现出高度的遗传多样性（0.8-0.9）。相比之下，来自柬埔寨和越南（2018-2019年）携带CVIET变体的寄生虫分离株显示出显著降低的多样性，尤其是在pfcrt基因座附近。
携带单倍型CVIET+T93S（n = 32）和CVIET+（H97Y, H97L；n = 52）的寄生虫表现出相似的模式，在-29.268 kb至0.59 kb之间缺乏多样性，表明存在潜在的选择性清除。在携带CVIET+F145I（n = 23）、+I218F（n = 22）和+G353V（n = 3）单倍型的寄生虫中观察到更明显的减少，其多样性值为零，尤其是在邻近区域。这些结果表明对这些与药物耐药性相关的单倍型存在强大的选择压力，与寄生虫种群中最近的选择性清除一致。
与氯喹耐药相关的pfcrt突变流行率
在来自五个国家的898份样本中，鉴定出四种pfcrt单倍型（密码子72-76）：C72-V73-M74-N75-K76（野生型），2.78%；C72-V73-M74I-N75E-K76T（突变型），85.41%；C72-V73-M74I-N75D-K76T（突变型），10.24%；以及混合类型（C72-V73-M74M/I-N75E-K76K/T和C72-V73-M74I-N75E/D-K76T），1.56%。CVIET单倍型在泰国、老挝、柬埔寨、缅甸和越南的研究点占主导地位。在柬埔寨，CVIET始终占主导地位。在拜林，从2007年到2017年，这种单倍型一直存在，但此后随着恶性疟原虫被有效消除，没有收集到更多样本。在上丁，观察到从2018-2019年的CVIDT向2020年100% CVIET的转变。在老挝，与柬埔寨相比，观察到更大的单倍型多样性，CVIET和CVIDT均存在。值得注意的是，野生型CVMNK在更早的年份（2003年，2010年）仍存在于沙湾拿吉。在缅甸的克伦邦（2015-2023年），CVIET是主要的单倍型，偶尔观察到野生型寄生虫（2016-2017年）。在泰国，CVIET在所有地点中最常见，尽管2016年在达府观察到一些单倍型多样性。在越南的平福省，记录了从2011-2012年的混合单倍型向2016年CVIET主导地位的转变。庆和省显示出CVIDT、CVIET和CVMNK单倍型的存在。
讨论
青蒿素联合疗法一直被用作东南亚地区无并发症恶性疟原虫感染的一线治疗。2002年至2004年间，在柬埔寨西部的拜林和泰国达叻报告了青蒿琥酯-甲氟喹治疗失败。由于青蒿琥酯-甲氟喹失败率上升，柬埔寨西部于2008年采用双氢青蒿素-哌喹作为一线疗法。然而，很快报告了双氢青蒿素-哌喹治疗失败，导致在有明显双氢青蒿素-哌喹失败的地区重新使用青蒿琥酯-甲氟喹。
在本研究中，我们报告了2011年至2020年间pfcrt突变（包括H97Y、T93S和I218F）的流行率，这一时期双氢青蒿素-哌喹是柬埔寨的一线治疗。从柬埔寨拜林收集的基线样本（2007-2008年，当时青蒿琥酯-甲氟喹仍是一线疗法）显示在T93S、H97L/Y、F145I、I218F、M343I和G353V位点没有pfcrt突变。此外，在从青蒿琥酯-甲氟喹改为双氢青蒿素-哌喹后，拜林的pfplasmepsin2基因扩增从2007-2008年的20%增加到2011-2015年的100%。这些发现表明，pfcrt突变和pfplasmepsin2基因扩增都有助于哌喹耐药性。
柬埔寨从2007年到2019年pfcrt突变和pfplasmepsin2拷贝数变化的时间演变揭示了显著的遗传转变。2007年，pfcrt突变罕见，只有约10%的寄生虫具有pfplasmepsin2的多拷贝。然而，在2008年引入双氢青蒿素-哌喹后，pfcrt突变和pfplasmepsin2扩增均急剧上升。在柬埔寨，CVIET始终占主导地位，但在上丁，2018-2019年从CVIDT转变为2020年100%的CVIET。这一转变发生在此区域自2017年起使用青蒿琥酯-甲氟喹之后。此外，从2018年TACTCV研究开始时，蒿甲醚-本芴醇和蒿甲醚-本芴醇-阿莫地喹三重联合疗法被引入作为研究药物。pfplasmepsin2扩增的流行率在2015年达到近90%的峰值，而pfcrt突变总数在2017年达到约90%。值得注意的是，H97Y突变在2016年后强劲出现，并在2017年左右达到峰值，而G353V在后期保持稳定存在。与最近一项研究相比，该研究报告称，柬埔寨携带H97Y突变的寄生虫分离株比例在2020年最高，随后在2021年和2022年下降，我们的研究结果显示了相似的模式。在我们的研究中，H97Y的流行率有所下降，但在2019年似乎再次上升，2020年的研究也报告了较高的流行率。2017年之后，pfcrt突变和pfplasmepsin2扩增均显著下降，到2019年稳定在约40%，这与柬埔寨在2014年至2017年间逐步回归青蒿琥酯-甲氟喹治疗的时间相吻合。根据最近的研究，pfplasmepsin2扩增的频率从2017-2019年的62%急剧下降到2022年的仅2%，这与柬埔寨、泰国和越南一线疟疾治疗的转变时间吻合。从本研究结果来看，这些发现也与之前在柬埔寨北部进行的研究结果一致，该研究报告了pfcrt H97Y突变自2014年开始出现，其流行
