植物共生类芽孢杆菌来源的新型杆菌肽家族抗生素的发现及研究意义

《mSystems》：Paenitracins, a novel family of bacitracin-type nonribosomal peptide antibiotics produced by plant-associated Paenibacillus species

本研究发现了一种由植物共生类芽孢杆菌产生的新型杆菌肽家族抗生素——Paenitracins。它对抗万古霉素耐药粪肠球菌等革兰氏阳性耐药菌表现出强效活性。研究整合了代谢组学-基因组学导向的靶向发现工作流，为加速抗生素发现提供了新策略，具有重要科学价值。

　　

摘要

鉴于日益严重的抗菌素耐药性（AMR）威胁，发现具有抗耐药菌活性的新型抗生素迫在眉睫。细菌天然产物（NPs）是抗菌化合物的丰富来源。本研究聚焦于类芽孢杆菌属（Paenibacillus）这一已知能产生多种非核糖体肽（NRPs）的重要资源库。研究者采用了一种基于靶向质谱查询语言（MassQL）的新方法，对227株植物来源的、具有丰富分类学多样性的类芽孢杆菌菌株产生的NRPs进行分析，深入揭示了其产生NRPs的潜力。通过MassQL专门针对含有碱性氨基酸的NRPs进行聚焦搜索，发现了一个新型杆菌肽家族，并将其命名为paenitracins。这是首个在类芽孢杆菌中报道的杆菌肽类型肽，与经典杆菌肽的区别在于三个前所未有的氨基酸替换。Paenitracins对包括万古霉素耐药粪肠球菌（vancomycin-resistant Enterococcus faecium）E155在内的革兰氏阳性病原体表现出强效活性。此项研究为发现具有生物活性的NRPs提供了一种新的、结合代谢组学与基因组学引导的工作流程，作为一种优先探索天然产物化学空间的策略，有望加速抗生素的发现。

引言

抗菌耐药性持续挑战全球健康，因此发现新抗生素是对抗由多重耐药病原体引起的感染性疾病的前提。细菌天然产物（NPs）是抗菌化合物的丰富储备库，其中许多已成功转化为临床应用。一个主要的挑战是如何在巨大的现有基因组空间中优先筛选出有潜力的NPs。

已知细菌门厚壁菌门（Bacillota，前身为Firmicutes）的成员因其产生多种抗菌剂，特别是非核糖体合成肽（NRPs）的潜力而广为人知。芽孢杆菌属（Bacillus）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）已产生了许多具有生物活性的NRPs，包括多粘菌素（polymyxins）、类杆菌素（paenibacterins）、多肽菌素（polypeptins）和十三肽菌素（tridecaptins）等。源自这些微生物的NRPs，如多粘菌素和杆菌肽（bacitracins），已在临床环境中得到应用。很大一部分NRPs含有带正电荷的氨基酸，并对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体具有强效的抗菌活性。

在NP发现过程中的挑战之一是快速鉴定已报道的化合物，即结构去重复化。液相色谱与高分辨质谱联用（LC-MS）在去重复化研究的早期阶段被广泛应用。全球天然产物社会分子网络（GNPS MN）的引入已成为处理串联质谱（MS）数据和执行分子网络（MN）的强大工具。MN概念基于通过谱图相似性图谱组织和可视化串联MS数据，揭示同源MS²碎裂的存在。结构相关的化合物共享相似的碎裂谱图，它们的节点倾向于聚集在一起，形成类似物的簇。

本研究旨在通过对227株类芽孢杆菌菌株进行全面的系统发育组学分析，并评估其产生NRPs的潜力。我们引入了一种早期优先化方法，该方法结合了基于特征的分子网络（FBMN）和MassQL搜索，以靶向鉴定由一组植物共生类芽孢杆菌产生的、具有潜在抗菌特性的含碱性氨基酸NRPs。

结果与讨论

类芽孢杆菌菌株集合的分类学和化学多样性

考虑到类芽孢杆菌产生的代谢物在药理学和生物技术方面的巨大潜力，我们分析了来自奥本大学植物共生微生物菌株收藏的227株类芽孢杆菌分离株。这些类芽孢杆菌物种分离自田间种植的玉米和豆类的根表。通过比较分离株的16S rRNA基因进行了菌株的分类学分析，并构建了最大似然树。

为了寻找新的NRPs，我们研究了类芽孢杆菌分离株产生的特化代谢物的化学多样性。为此，将所有227株分离物分别培养于胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）培养基中72小时，并用含0.1%甲酸的异丙醇提取。随后，粗提物被用于测试其对革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌ATCC 29213）和革兰氏阴性（大肠杆菌ATCC 25922）指示菌株的抗菌活性，以评估菌株的抗菌活性。所有粗提物随后进行LC-MS/MS分析，以确定导致观察到的生物活性的NPs。LC-MS/MS数据用MZmine 2处理，并导出用于GNPS FBMN分析。FBMN分析生成了一个包含3,096个母离子（节点）和3,692条边的分子网络。

基于质谱的MN允许聚类具有相似MS/MS碎裂模式的分子，这些模式源于其结构的相似性。这些簇允许对菌株产生的代谢物进行可视化探索，实现已知化合物的快速去重复化和未知化合物的可视化。已知代谢物通过将实验获得的MS/MS碎裂模式与GNPS数据库中注释和整理的MS/MS谱图进行匹配而去重复化。由于谱库搜索对类芽孢杆菌的NRPs效果不佳，我们创建了一个包含来自类芽孢杆菌和芽孢杆菌的已知NRPs的MS数据的内部数据库，用于去重复化已知代谢物。利用这个数据库，我们能够去重复化属于镰孢菌素（fusaricidins）、多粘菌素和十三肽菌素家族的脂肽。尽管在网络中鉴定出大量已知脂肽的假定类似物，但大多数产生的代谢物仍然未知。

使用MassQL辅助碎片搜索靶向阳离子脂肽

几种已鉴定的脂肽是众所周知的具有强效活性的抗生素，其活性通常归因于它们的净正电荷，这增强了与细菌细胞表面带负电组分（如细胞膜或脂多糖LPSs）的静电相互作用。因此，我们试图专门检测那些含有一个或多个带正电荷氨基酸残基、具有潜在生物活性的脂肽。为实现这一目标，将基于特征的谱图相似性网络与MassQL搜索查询相结合，以靶向包含最常见带正电荷氨基酸的MS/MS谱图。对2,4-二氨基丁酸（Dab）、鸟氨酸（Orn）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）的b离子和组氨酸（His）的铵离子的碎片搜索在m/z精度0.005和最小强度5%的条件下进行。

对含Dab母离子的MassQL搜索突出显示了先前已去重复化的多粘菌素和十三肽菌素谱图家族。在许多类芽孢杆菌提取物中鉴定出不同的多粘菌素和十三肽菌素类似物，突显了我们菌株集合的化学多样性。尽管多粘菌素和十三肽菌素结构各异，但其共同特征是存在多个Dab氨基酸残基。此外，MassQL揭示了一个含有两种不同氨基酸残基（即鸟氨酸和赖氨酸）的化合物的谱图家族。有趣的是，该簇中的化合物仅由整个菌株集合中的两株分离物产生。这些化合物无法通过谱库和内部数据库搜索去重复化。广泛的文献检索和手动MS/MS去重复化将这些化合物注释为类杆菌素A（paenibacterin A）类似物。

发现一个新的杆菌肽家族

除了已注释的脂肽类别，我们还鉴定出多个含有碱性氨基酸（如赖氨酸、鸟氨酸和组氨酸）的未知分子家族。一个含赖氨酸的分子家族脱颖而出，因为其产生仅局限于少数分离株。该含赖氨酸分子家族可分为三个亚家族。亚家族1和2中的节点代表与最近发现的脂肽paenilipoheptins A和B相对应的质量特征。第三亚家族包含双电荷分子离子，其质量明显大于paenilipoheptins。

该亚家族中所有质量特征的MS/MS谱图都显示出一个m/z为199.0897的离子。然而，这些质量特征无法与已知的微生物NPs匹配。对m/z为712.8836的母体化合物的MS/MS谱图分析表明，一个m/z为199.0897的碎片离子的分子式为C₉H₁₅N₂OS，这对应于通常存在于肽类抗生素杆菌肽中的含噻唑啉亚结构，迄今为止仅在芽孢杆菌属中发现。基于b₂、b₃、b₄和b₅离子在母体质量特征和杆菌肽A之间共享这一事实，我们得出结论，它们的五肽侧链是相同的。在b₆–b₁₁离子中观察到的差异表明，两种代谢物之间的结构区别在于七肽环。我们没有观察到对应于杆菌肽A结构中存在的鸟氨酸、苯丙氨酸或组氨酸的碎片离子，但可以确定存在一个对应于色氨酸残基的离子。通过追踪b和y离子系列，我们阐明了m/z为712.8836的化合物的氨基酸序列为(Ile-Cys)–Leu/Ile–Glu–Leu/Ile–Lys–Leu/Ile–Leu/Ile–Trp–Thr–Asp–Asn。值得注意的是，该序列与任何已知的杆菌肽类似物都不同，表明发现了重要的杆菌肽家族NRPs的一个新分支。

为了纯化合以进行更详细的研究，对类芽孢杆菌sp. JJ-778进行了大规模培养，并经过多轮色谱纯化，分离出化合物1和2。两者的分子式均为C₆₇H₁₀₆N₁₅O₁₇S。1的一维和二维核磁共振（NMR）分析确认了氨基酸序列，结合精确质量确定的分子式，确定了1的结构为一种新的杆菌肽类似物。NMR分析确定了第3和第7位为亮氨酸残基，第5和第8位为异亮氨酸残基。1和2的¹H NMR谱图几乎相同，表明它们是差向异构体。因此，将这些新化合物命名为paenitracin A（1）和paenitracin B（2）。

为了验证特定残基的同一性和立体化学，使用Marfey法分析了化合物1和2。该分析确认了存在d-Glu、l-Lys、l-Thr和l-Ile作为单一异构体。此外，发现分子中同时存在l和d构型的亮氨酸异构体，并且还观察到天冬酰胺和天冬氨酸残基表现出不同的立体化学。然而，噻唑啉部分和色氨酸的立体化学无法确定。1和2的¹H NMR谱图几乎相同，除了对应于噻唑啉部分的区域，表明这些分子是差向异构体，立体化学的模糊性源于噻唑啉部分。

杆菌肽最初从地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中分离得到，由杆菌肽合成酶操纵子编码的非核糖体肽合成酶（NRPS）复合物合成。为了探索新型paenitracin的生物合成，对类芽孢杆菌sp. JJ-778的基因组进行了测序和组装。使用antiSMASH 7.1.0分析，轻易地鉴定出一个12个模块的基因簇，与地衣芽孢杆菌ATCC 10716的杆菌肽生物合成基因簇（BGC）有77%的相似性。对BacA、BacB和BacC的A域底物特异性的in silico分析预测，与众所周知的杆菌肽A相比，在第7、9和10位的氨基酸组成存在变异。使用软件工具PARAS对paenitracin BGCs的A域底物特异性进行了in silico分析。

迄今为止分离和鉴定的所有已知杆菌肽类似物都表现出相似的氨基酸组成，异亮氨酸残基偶尔被缬氨酸取代。相比之下，paenitracin在第7、9和10位分别含有亮氨酸、色氨酸和苏氨酸，而不是鸟氨酸、苯丙氨酸和组氨酸。这使得paenitracin成为杆菌肽在结构上较远的亲属。综上所述，Marfey数据以及paenitracin NRPS的结构域架构使我们能够提出该肽的绝对构型。

Paenitracins的作用模式和生物活性

杆菌肽主要通过特异性靶向细菌特有的脂质载体十一碳戊烯基焦磷酸（C₅₅PP）来对抗革兰氏阳性细菌。C₅₅PP是膜相关磷脂，它锚定脂质II，并在合成它的细胞质与细胞壁生长处的外膜之间穿梭。为了验证paenitracin是否确实具有与杆菌肽相同的作用模式，在锌存在与否的情况下，通过抗菌活性拮抗实验测试了paenitracin A活性对C₅₅PP的依赖性。拮抗实验表明，paenitracin A的活性仅在Zn²⁺存在下被C₁₀PP拮抗。这表明paenitracin以锌依赖的方式与革兰氏阳性细菌的C₅₅PP结合，因此具有与杆菌肽相同的作用模式。

为了解paenitracins A和B的抗菌谱，我们针对一组代表性指示菌株进行了最低抑菌浓度（MIC）测定。在MIC测定中使用的培养基补充了0.3 mM ZnSO₄，以提供杆菌肽活性所需的二价金属离子。Paenitracin B对革兰氏阳性菌表现出活性，MIC范围为1至8 μg/mL，与商业杆菌肽相当。先前报道对杆菌肽耐药的枯草芽孢杆菌168对paenitracins A和B也表现出敏感性降低，MIC值为32 μg/mL。重要的是，paenitracin B对万古霉素耐药粪肠球菌E155表现出活性，MIC为2 μg/mL，低于市售杆菌肽的MIC。

总之，基于质谱的227株植物共生类芽孢杆菌分离株NRPs索引揭示了广泛的化学多样性。FBMN结合MassQL鉴定了几类脂肽，我们特别关注了含有碱性残基的NRPs。这揭示了杆菌肽的远亲，我们将其命名为paenitracins。Paenitracins A和B对包括万古霉素耐药粪肠球菌E155在内的革兰氏阳性ESKAPE病原体显示出强效的生物活性。与先前描述的杆菌肽变体不同，paenitracins显示出显著的结构差异，并代表了类芽孢杆菌中杆菌肽家族NRPs的首个例子。这些发现突显了该类芽孢杆菌属内未开发的化学空间，并展示了将代谢组学索引与靶向挖掘策略相结合以加速发现结构独特抗生素的强大能力。