N-糖基化对有机阴离子转运多肽（OATP）1B1转运动力学的调控机制：单分子内在活性研究

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Effects of N-glycosylation on the transport kinetics of organic anion transporting polypeptide (OATP) 1B1

本研究针对OATP1B1蛋白N-糖基化修饰对其内在转运活性影响不明的问题，通过建立一系列糖基化位点突变体，并结合LC-MS/MS精准定量膜表面蛋白水平，系统评估了N-糖基化对OATP1B1膜表达及单分子转运参数（Km、Vmax,c）的影响。研究发现，N-糖基化缺失不仅降低OATP1B1的膜定位，还损害其内在转运效率。其中，Asn134位点的糖基化对维持正常转运功能尤为关键。该工作首次明确了N-糖基化在调节OATP1B1内在转运活性中的作用，为理解病理状态（如代谢功能障碍相关脂肪性肝炎）下药物处置改变提供了机制性见解。

　　

肝脏是人体的“解毒工厂”，负责处理药物、激素等外来和内在物质。其中，一个名为有机阴离子转运多肽1B1（OATP1B1）的蛋白质扮演着“门卫”的关键角色，它主要负责将多种临床药物（如他汀类降脂药）和体内物质从血液中摄取进入肝细胞，从而影响药物的疗效和安全性。蛋白质的N-糖基化是一种常见的“装饰”过程，就像给蛋白质贴上“定位标签”，影响其正确折叠和运输到细胞表面。OATP1B1已知有三个N-糖基化位点：Asn134、Asn503和Asn516。此前的研究已经表明，如果破坏这些“标签”（例如通过基因突变），OATP1B1就很难被运输到肝细胞的表面“执勤”，但其转运能力本身是否会受损，一直是个未解之谜。也就是说，我们不清楚这个“门卫”上岗人数减少，是不是因为他本身的“工作效率”（内在活性）也下降了。这个问题在病理状态下尤为关键，例如在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）患者中，已观察到OATP1B1的非糖基化形式增加。因此，阐明N-糖基化对OATP1B1单个分子转运能力（内在活性）的具体影响，对于精准预测疾病状态下的药物动力学变化、保障用药安全具有重要意义。

为了回答上述问题，研究人员系统性地开展了一项体外研究。他们首先构建了7个表达不同N-糖基化位点突变（单个、双个及三突变）OATP1B1蛋白的HEK293稳定细胞系。随后，利用2′,7′-二氯荧光素（DCF）作为模型底物，通过经典的摄取实验测定其转运动力学参数，包括米氏常数（K_m，反映底物亲和力）和最大转运速率（V_max）。研究的关键创新在于，他们采用了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术精确量化了细胞膜组份中OATP1B1的绝对蛋白含量，从而能够计算出单个OATP1B1分子的最大转运速率（V_max,c），实现了对蛋白质“内在活性”的精准评估。同时，通过蛋白质印迹（Western blotting）分析了突变体蛋白的分子量变化，以确认糖基化状态的改变。

研究结果

3.1. 人工N-糖基化位点突变OATP1B1的mRNA和蛋白表达

所有突变体细胞系中SLCO1B1（编码OATP1B1的基因）mRNA的表达水平与野生型相当，这表明后续观察到的表型差异并非由基因转录水平差异引起。Western blotting分析显示，经PNGase F（N-糖苷酶）处理后，野生型OATP1B1的条带分子量从约80 kDa降至约50-60 kDa，证实了其糖基化状态。所有突变体蛋白均显示出比野生型更低的分子量，表明糖基化修饰确实被破坏。其中，Asn134Gln和Asn503Gln单突变体的条带强度显著降低。在所有双突变体和Asn134/503/516Gln三突变体中，80 kDa处的条带消失，主要检测到约50-60 kDa的条带，在三突变体中该条带信号非常微弱，提示多个糖基化位点同时缺失严重影响了OATP1B1蛋白在质膜上的稳定表达。

3.2. OATP1B1蛋白表达及DCF转运动力学

时间依赖性摄取实验确定了所有细胞系中DCF摄取的线性期为5分钟，因此后续浓度依赖性实验选择5分钟作为孵育时间。通过LC-MS/MS定量发现，Asn134Gln和Asn516Gln突变体的质膜蛋白表达量（Q_1B1）反而高于野生型（分别为1.65和1.53倍），而其他突变体，特别是Asn134/503/516Gln三突变体，其表达量显著降低至野生型的0.35倍。

浓度依赖性摄取分析揭示了N-糖基化缺失对转运动力学的复杂影响：

• •
  对底物亲和力的影响：Asn134/503Gln和Asn134/503/516Gln突变体的K_m值显著降低，分别仅为野生型的0.29和0.33倍，表明糖基化缺失可能反而增强了OATP1B1对底物DCF的表观亲和力。
• •
  对内在转运活性的影响：在归一化至单个转运分子后，Asn134/503Gln和Asn134/503/516Gln突变体的V_max,c（单个分子的最大转运速率）也显著降低，分别降至野生型的0.24和0.23倍。这表明N-糖基化缺失不仅减少了“上岗人数”，还降低了每个“门卫”的“工作效率”。
• •
  对内在清除率的影响：综合了亲和力和转运速率的单分子最大摄取清除率（CL_max,c= V_max,c/ K_m）在Asn134Gln、Asn134/503Gln、Asn503/516Gln和Asn134/503/516Gln突变体中均低于野生型（0.65至0.78倍）。特别是Asn134/503/516Gln三突变体的CL_max,c降至野生型的65%。相反，Asn516Gln和Asn134/516Gln突变体的CL_max,c有高于野生型的趋势（1.34至1.57倍），提示不同位点的糖基化可能对转运功能有不同甚至相反的影响。

研究结论与讨论

本研究首次通过定量手段（LC-MS/MS）明确揭示了N-糖基化对OATP1B1的调控具有双重作用：它不仅对于该转运蛋白在质膜上的正确定位和稳定表达至关重要，还直接影响了其单个分子的内在转运活性。

具体而言，研究结论可归纳为以下几点：

1. 1.
   Asn134是关键的糖基化位点：Western blotting和功能数据均支持Asn134是主要的糖基化位点，其修饰对OATP1B1的质膜表达和内在活性均有重大影响。Asn134位点糖基化的缺失是导致内在清除率（CL_max,c）下降的主要因素。
2. 2.
   糖基化缺失改变转运动力学参数：破坏N-糖基化（特别是涉及Asn134的突变）会导致底物亲和力（K_m降低）和单个分子的最大转运速率（V_max,c降低）发生改变。K_m的降低可能与糖链缺失后，底物进入跨膜区结合口袋的空间位阻或疏水性减少有关，从而更容易接近结合位点。而V_max,c的下降可能源于糖基化缺失影响了蛋白质的构象稳定性或转运循环中的某个限速步骤。
3. 3.
   病理状态下的临床意义：在MASH等病理状态下，肝脏中非糖基化OATP1B1的比例增加。本研究表明，非糖基化形式的OATP1B1不仅膜表达量可能减少，其单个分子的转运能力（CL_max,c）也下降了约35%。这两种效应叠加，可能导致患者肝脏对OATP1B1底物药物（如他汀类）的摄取能力显著受损，从而引起药物系统暴露量意外升高，增加药物毒性风险。
4. 4.
   研究方法的先进性：相较于以往仅通过Western blotting半定量或通过总细胞蛋白归一化的方法，本研究采用LC-MS/MS对质膜组份中的OATP1B1进行绝对定量，能够更准确地区分“表达量变化”和“活性变化”，为精细解析翻译后修饰对转运体功能的影响提供了可靠范式。

总之，这项发表在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》上的研究，从分子机制层面深化了我们对OATP1B1功能调控的理解。它明确指出，在评估疾病（如MASH）对肝脏药物处置能力的影响时，不仅要关注转运蛋白表达量的变化，还需考虑其翻译后修饰（如糖基化）状态改变所导致的内在活性变化。这为未来实现更个体化、更精准的给药方案提供了重要的理论依据。