利用极化液-液界面（ITIES）实时电化学监测乙酰胆碱酯酶活性与抑制：面向海洋环境神经毒性污染物的新型生物传感平台

《Biosensors and Bioelectronics》：Assessing acetylcholinesterase activity at a polarizable liquid|liquid interface

研究人员针对传统乙酰胆碱酯酶（AChE）活性检测方法在复杂基质（如海水）中应用受限的问题，开发了一种基于不可混溶液体界面（ITIES）的电化学新方法。该方法无需氧化还原介质或酶促级联，可直接实时监测乙酰胆碱（ACh+）水解生成胆碱（Ch+）的离子转移过程，成功用于复杂海水环境中AChE活性的评估及其对马拉硫磷抑制的检测，为开发环境神经毒性污染物现场检测传感器提供了新思路。

　　

在大海蔚蓝的表面之下，一个看不见的威胁正悄然扩散：有机磷和氨基甲酸酯类农药等神经毒性污染物。它们通过阻断乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性，干扰水生生物的神经信号传递，并最终通过食物链累积，威胁人类健康。然而，在复杂的海水环境中快速、准确地监测这些污染物及其对AChE的抑制效应，一直是个技术挑战。传统方法要么依赖繁琐的多步骤反应，要么受限于基质干扰。正是在这样的背景下，一篇发表在《Biosensors and Bioelectronics》上的研究，为我们带来了一个创新的解决方案——利用极化液-液界面（ITIES）这一独特平台，直接“窥视”酶催化反应的实时动态。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几个关键技术方法：首先，搭建了基于四电极体系的电化学池，采用α,α,α-三氟甲苯（TFT）为有机相，以双（三苯基磷亚基）铵四（五氟苯基）硼酸盐（BATB）作为有机支持电解质，水相则分别采用Trizma缓冲液和模拟海水。其次，核心检测技术是离子转移循环伏安法（Cyclic Voltammetry, CV）。通过测量在特定电势下ACh⁺和Ch⁺跨界面转移产生的电流，实现对这两种非氧化还原活性离子的直接、实时检测。最后，通过向体系中加入不同浓度的有机磷农药马拉硫磷，并监测其对AChE催化电流信号的影响，建立了评估酶抑制效应的定量方法。

3.1. 乙酰胆碱和胆碱的电化学行为

研究人员首先在Trizma缓冲液和模拟海水两种水相中，评估了底物ACh⁺和产物Ch⁺在ITIES上的电化学行为。循环伏安图显示，两者在两种介质中均表现出可逆的离子转移峰，且峰电流密度与其浓度在0-25 μM范围内呈线性关系。在模拟海水中，ACh⁺和Ch⁺的半波电位（Δ_o^w?_1/2）相差约60-80 mV，这为同时监测酶促反应中两者的浓度变化提供了足够的电位分辨率。这证明了ITIES系统在复杂离子环境中直接检测ACh⁺和Ch⁺的可行性。

3.2. AChE酶活性的评估

研究的关键在于证明该方法能实时追踪酶促反应。将AChE酶和底物ACh⁺加入体系后，通过连续扫描CV，研究人员观察到ACh⁺的离子转移峰电流随时间逐渐下降，而Ch⁺的峰电流则相应上升，清晰地呈现了ACh⁺被水解转化为Ch⁺的动态过程。通过对峰电流变化（Δj）与时间的分析，可以计算出酶反应的表观速率。值得注意的是，AChE在模拟海水中的活性（2.6 ± 0.2 μM min^-1）虽然略低于在Trizma缓冲液中的活性（2.9 ± 0.4 μM min^-1），但仍然保持显著催化能力，证明了该方法在模拟真实海洋环境下的适用性。

3.3. 在极化海水|TFT界面上电化学监测AChE酶活的抑制

为了展示该平台的传感应用潜力，研究人员评估了有机磷农药马拉硫磷对AChE的抑制效应。在加入不同浓度马拉硫磷并孵育后，再启动酶促反应，监测电流变化。结果显示，随着马拉硫磷浓度增加，表征酶活性的平均电流密度变化（Δj_average）显著降低。通过计算相对酶活度REA(10)（反应10分钟时抑制组与空白组的Δj_average比值），发现抑制效果具有浓度依赖性：在10 μM时REA(10)约为0.46，在50-100 μM时达到饱和平台约0.29。基于此校准曲线，估算出该方法对马拉硫磷的检测限为73 nM。这项工作证明，该ITIES平台能够灵敏、定量地检测环境相关浓度下的AChE抑制剂。

结论与讨论

本研究成功开发并验证了一种基于极化液-液界面（ITIES）的新型电化学平台，用于直接、实时监测乙酰胆碱酯酶（AChE）的催化活性及其抑制。该方法的根本创新在于，它绕过了传统方法对氧化还原介质、多酶系统或特殊底物的依赖，直接通过离子转移伏安法检测酶促反应中天然底物（ACh⁺）和产物（Ch⁺）的浓度变化。

研究的重要结论包括：第一，ITIES系统能够在Trizma缓冲液和成分复杂的模拟海水环境中，高分辨率地同时检测ACh⁺和Ch⁺。第二，该系统成功实现了对AChE水解ACh⁺这一动态过程的实时追踪，并计算出表观酶活。第三，也是最具应用价值的一点，该系统被证明可用于定量评估神经毒性污染物（如马拉硫磷）对AChE的抑制效应，检测性能（73 nM LOD）与文献中报道的多种电化学传感方法相当，且具备操作简单、无需标记、对复杂基质耐受性强等优势。

这项工作的重要意义在于，它将ITIES从一个主要用于研究离子转移或蛋白质-界面相互作用的物理化学平台，拓展为一个功能性的酶促反应电化学转导器。它为开发下一代用于环境监测（尤其是海洋环境）的现场部署式生物传感器提供了全新的思路和强大的工具原型。未来的工作可以着眼于系统的微型化（如制备微/纳米ITIES阵列）和集成化，以推动其走向实际应用。总的来说，该研究不仅为AChE相关的基础酶学研究提供了新工具，也为快速、灵敏检测水体中的神经毒性污染物开辟了一条有前景的新途径。