《PLOS Pathogens》：Development of a qPCR assay for Fasciola spp. identification and deep amplicon sequencing method for differentiation of fluke species in UK livestock
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本篇研究针对传统镜检法在反刍动物吸虫病诊断中灵敏度、特异性不足且无法区分混合感染的问题，开发了两种新型分子检测工具。首先，建立了一种靶向线粒体NADH1 (mt-ND1) 基因的SYBR Green qPCR方法，能特异性检测Fasciola属（肝片吸虫），灵敏度高达19.2/6.4 fg DNA。其次，开发了一种基于ITS2区域的深度扩增子测序技术，首次实现了对动物粪便沉淀物中吸虫卵的虫种水平区分，可精准识别Fasciola hepatica和Calicophoron daubneyi（瘤胃吸虫）的混合感染。通过对英国402份实地样本的验证，发现二者混合感染率高达14.4%。该研究为提升片形吸虫病（Fasciolosis）的监测与防控能力提供了有力的补充工具。
文章内容归纳总结
引言
吸虫（Trematode parasites/flukes）是全球反刍动物生产的重要经济威胁，其中全球范围内主要感染牛和羊的是肝片吸虫Fasciola hepatica和Fasciola gigantica，以及欧洲主要的瘤胃吸虫Calicophoron daubneyi。传统诊断方法依赖粪便中虫卵的镜检（microscopy），该方法耗时且缺乏灵敏度与特异性，尤其是在区分虫卵形态相似的虫种（如F. hepatica和C. daubneyi）时容易误判。尽管数字成像和人工智能等新技术正在发展，但仍需可靠、经济、高效且能区分虫种、适用于中大批量样本的诊断方法。下一代测序（NGS）技术，如扩增子测序，已在其他寄生虫（如胃肠道线虫）的虫种鉴定（“线虫组”， nemabiome）中成功应用，但尚未应用于自然感染动物粪便沉淀物中肝片吸虫和瘤胃吸虫的单一及混合感染检测。
本研究旨在开发和验证两种检测方法：一是开发SYBR Green qPCR方法，用于从粪便沉淀的虫卵DNA中准确鉴定Fasciola spp.；二是开发深度扩增子测序技术，用于区分吸虫虫种并识别混合感染。
材料与方法
伦理声明与样本来源：非侵入性粪便样本收集获得英国萨里大学（University of Surrey）伦理委员会批准。研究收集了来自英国各地19个牛、羊养殖场的402份粪便样本。阳性对照样本（成虫和虫卵）来自英国和巴基斯坦的屠宰场。成虫通过形态学鉴定后，取其头部组织（不含虫卵）用于DNA提取。
样本处理与形态学鉴定：粪便样本通过标准沉淀法或改良的Flukefinder装置处理，沉淀物用亚甲蓝染色后，在显微镜下观察计数，并基于虫卵大小、形状、颜色和卵盖等形态特征初步鉴定虫种。
分子鉴定：使用通用ITS2引物对镜检阳性的样本进行PCR扩增，随后进行Sanger测序以确认虫种。
SYBR Green qPCR的开发与验证：采用靶向Fasciola spp.线粒体NADH1 (mt-ND1)基因的引物建立SYBR Green qPCR检测体系。通过连续稀释的成虫DNA评估其分析灵敏度（F. hepatica为19.2 fg，F. gigantica为6.4 fg）和特异性（与其他吸虫及线虫无交叉扩增）。对镜检阳性和随机选择的30份阴性样本进行检测验证。
深度扩增子测序的开发与验证：针对21种吸虫的ITS2 rDNA区域设计通用引物，建立参考序列库和分类学文件。通过构建不同比例（如99:1, 50:50）和不同数量（低至5个卵）的F. hepatica和C. daubneyi虫卵混合池（mock mixtures），验证该方法的检测阈值和物种代表性。随后，将此方法应用于镜检阳性的实地粪便样本DNA。测序数据在Mothur/1.41.0中进行生物信息学分析，并与NCBI数据库比对进行虫种鉴定和扩增子序列变体（ASVs）分析。
统计分析：计算qPCR的标准曲线、检测限和变异系数。采用受试者工作特征（ROC）曲线和Cohen’s kappa系数评估不同检测方法（镜检、Sanger测序、qPCR、深度测序）之间的一致性。通过方差分析（ANOVA）评估不同PCR循环数对测序中物种代表性的影响。
结果
镜检与Sanger测序：在402份粪便样本中，128份（31.84%）镜检为吸虫卵阳性。然而，镜检与Sanger测序结果一致性很低（Cohen’s kappa = 0.05），ROC曲线下面积（AUC）值也显示二者对F. hepatica和瘤胃吸虫的鉴定一致性较差，且Sanger测序无法有效识别混合感染，部分样本还出现了测序质量不佳的问题。
qPCR检测Fasciola spp.：新开发的qPCR方法对F. hepatica和F. gigantica的DNA检测限分别低至19.2 fg和6.4 fg，且特异性良好。熔解曲线分析显示，F. hepatica和F. gigantica分别在81.5°C和82°C处有特征峰，与其他吸虫或线虫无交叉。该方法在应用于实地样本时，与镜检结果的一致性仍然不高（Cohen’s kappa = 0.16），但虫卵计数（FEC）与qPCR的Cq值之间存在显著负相关（R2= 0.22）。
深度扩增子测序检测吸虫虫种：深度测序方法在验证实验中能够检测到低至5个虫卵的F. hepatica和C. daubneyi，并能识别混合感染。然而，研究也观察到物种间的序列读长（reads）存在偏差，C. daubneyi的读长比例始终高于其实际虫卵比例。将深度测序应用于125份实地样本后，成功在122份样本中检测到序列读长。结果显示，在牛和羊的样本中，混合感染（F. hepatica 和 C. daubneyi）的检出率最高，其次为单一的C. daubneyi和F. hepatica感染。此外，通过系统发育分析，从测序数据中鉴定出F. hepatica的55个ASVs和C. daubneyi的32个ASVs，它们各自聚集在独立的进化枝上。
不同方法的比较：
- 1.
镜检 vs. 深度测序：镜检鉴定为F. hepatica的样本中，深度测序仅确认了少量为单一感染，而更多被鉴定为C. daubneyi单一感染或混合感染。两者的一致性仍然较低。
- 2.
qPCR vs. 深度测序：有20份qPCR阴性的样本，深度测序检测到了F. hepatica序列（3份单一感染，17份混合感染）。反之，有8份qPCR阳性的样本，深度测序未检出F. hepatica读长（但检出了C. daubneyi）。总体来看，qPCR与深度测序在鉴定F. hepatica感染上具有中等程度的一致性（Cohen’s kappa = 0.54）和显著关联。
- 3.
Sanger测序 vs. 深度测序：深度测序发现了许多被Sanger测序判定为单一感染的样本实际上是混合感染，凸显了深度测序在识别混合感染方面的优势。
讨论
本研究开发的SYBR Green qPCR方法为Fasciola spp.的检测提供了一种高灵敏度、高特异性且成本较低的分子工具。与传统的镜检和Sanger测序相比，深度扩增子测序技术能更准确地在虫种水平上进行鉴别，特别是能有效揭示F. hepatica和C. daubneyi的高比例混合感染，这对于制定针对性的防控策略（因为两种吸虫的致病性和治疗方案可能不同）具有重要意义。尽管深度测序存在物种读长比例偏差、对设备和生物信息学分析要求较高等局限性，但它为处理大批量样本、进行精准虫种鉴定和监测种群遗传多样性提供了强有力的手段。研究还指出，未来可将这些方法应用于人类和环境样本的监测，符合“一体化健康”（One Health）理念，并可能通过与机器学习等预测分析工具结合，进一步提升片形吸虫病的防控能力。
结论
本研究成功开发并验证了用于检测Fasciola spp.的qPCR方法和用于区分吸虫虫种的深度扩增子测序方法。深度测序是检测混合感染的首选方法，其在英国农场反刍动物中发现了高频的F. hepatica和C. daubneyi混合感染。这些分子工具可作为现有诊断方法（如镜检）的有力补充，为加强牲畜及人类片形吸虫病的监测与控制提供了宝贵的额外手段。
