综述：胃肠道肿瘤活检标本预后及预测性生物标志物评估的充分性标准和报告：意大利胃肠道病理学家小组及意大利解剖病理学和细胞学学会分会（GIPAD-SIAPeC-IAP）立场声明

《Digestive and Liver Disease》：Adequacy criteria and reporting for prognostic and predictive profiling of biopsies from gastrointestinal neoplasia: A position paper from the Italian group of gastrointestinal pathologists, section of Italian society of anatomic pathology and cytology (GIPAD-SIAPeC-IAP)

这篇立场声明由意大利胃肠道病理学家小组撰写，旨在为消化系统肿瘤（如胃癌、结直肠癌等）的活检标本评估提供一份全面的临床病理指南。文章系统性地阐述了从活检采集到诊断报告全过程中，如何对预后和预测性生物标志物（如HER2、PD-L1、MMR、CLDN18.2等）进行充分评估。它重点关注了小样本（活检）带来的挑战，详细探讨了影响检测准确性的多种因素，包括分析前（如冷缺血时间、固定）、分析中（如抗体选择、活检数量）和分析后（如报告规范）的注意事项，并为不同肿瘤类型提供了具体的检测建议和充分性标准。

　　

精准医疗的进步为越来越多的胃肠道（GI）肿瘤患者带来了个性化的治疗策略。尤其在晚期/转移性患者中，手术治疗已不适用，此时，组织病理学诊断和生物标志物评估就成为了制定治疗方案的基石。然而，这类患者通常只能获得有限的活检或细胞学样本，其中肿瘤细胞含量少，如何妥善管理这些珍贵的样本，获取所有必要信息，同时避免不必要的浪费，已成为病理学家面临的重大挑战。影响生物标志物检测的因素众多，主要包括分析前问题、生物标志物表达的异质性，以及检测和评估标准的缺乏。此外，在转移性肿瘤的评估中，临床信息不足可能导致不恰当的样本处理，带来负面影响。

1. 影响生物标志物评估的分析前、分析和分析后因素

为确保检测结果的可靠性，必须严格控制整个检测流程中的各个环节。

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  分析前因素：这是决定检测质量的首要步骤。
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    冷缺血时间：指组织离体到浸入福尔马林固定的间隔时间。延长冷缺血时间会显著降低HER2免疫组化染色和FISH信号强度，并导致PD-L1染色不佳或假阴性结果。建议将冷缺血时间控制在1小时或更短。
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    固定时间：固定不足或过度都会影响免疫组化和分子检测结果。例如，结直肠癌样本固定时间不足20小时或超过90小时，可能导致错配修复（MMR）蛋白（尤其是MLH1和PMS2）的免疫组化评估结果不充分。美国病理学家学会（CAP）指南建议，使用10%中性缓冲福尔马林固定，活检样本固定6-36小时（以24小时为佳），手术标本固定24-48小时。
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    样本储存：福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块和切片的“年龄”会影响检测。尤其是PD-L1等膜蛋白和核蛋白的染色强度会随储存时间延长而减弱。因此，不建议使用存放超过3年的FFPE组织块和切片时间超过30天的白片进行关键生物标志物检测。
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  分析中因素：涉及具体的检测技术和操作。
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    抗体克隆选择：不同抗体克隆对同一生物标志物的检测结果可能存在差异。例如，评估PD-L1时，临床实践中获批的克隆包括Dako 28–8、Dako 22C3和Ventana SP263，它们在亚理想条件下可能表现出染色不一致。
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    活检样本和肿瘤细胞的最少数量：考虑到胃肠道肿瘤（尤其是胃/胃食管结合部癌）存在显著的瘤内异质性，以及并非所有活检条都含有浸润性癌成分，获取足够数量和质量的样本至关重要。评估HER2和CLDN18.2时，建议获取至少5-8条具有代表性的浸润性肿瘤活检样本。评估MMR和PD-L1时，则要求至少评估100个肿瘤细胞，且理想情况下应来自至少5条不同的活检样本。
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    评估浸润性肿瘤成分：许多胃肠道肿瘤的发生伴随癌前病变（如异型增生）。研究表明，HER2扩增、PD-L1表达甚至dMMR状态都可能出现在癌前病变中，且可能与浸润性成分的状态不一致。因此，生物标志物评估应仅针对浸润性癌成分，仅包含异型增生的样本应被视为“不充分”。
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  分析后因素：主要指病理报告的规范化。
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    报告内容：病理报告应包含对组织充分性的说明，例如，用于评估的浸润性癌活检条数是否≥6条，或肿瘤细胞数是否≥100个。同时，应报告所采用分析方法的敏感性/特异性，以及用于分子检测的核酸质量（如DNA完整性指数DIN/RNA完整性指数RIN）。

2. 生物标志物的选择与挑战

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  检测时机与优先级：在晚期/转移性患者样本量有限的情况下，需与肿瘤内科医生讨论，根据治疗方案的先后顺序，优先检测关键生物标志物。反射性检测（即在诊断时即完成所有必要检测）是优化组织利用和缩短治疗等待时间的理想方式。
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  原发灶与转移灶的选择：肿瘤的时空异质性给检测带来了挑战。例如，胃癌/胃食管结合部癌的原发灶与配对转移灶之间，HER2、PD-L1和CLDN18.2状态存在不同程度的差异（HER2不一致率可达0-26%），这可能导致仅检测一处病灶会错失治疗机会。而结直肠癌的KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA突变在原发灶与转移灶间则具有高度一致性（93%-100%）。MMR状态在胃癌和结直肠癌中原发灶与转移灶的一致性较高，但仍存在少量不一致的报道。
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  临床信息的必要性：充分的临床信息（肿瘤史、影像学、实验室数据等）对正确处理样本至关重要。对于来源不明的转移性肿瘤，若缺乏临床信息，盲目进行免疫组化分型或分子检测可能浪费珍贵的组织却无法明确诊断。此时，应先进行形态学诊断，待获得充分临床信息后再行生物标志物检测。

3. 各类胃肠道肿瘤的关键预测性生物标志物

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  食管癌
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    主要关注PD-L1。晚期/转移性食管鳞状细胞癌的免疫治疗需评估PD-L1表达。常用评分系统包括肿瘤比例评分（TPS，≥1%为阳性）、联合阳性评分（CPS，≥10为阳性阈值之一）和肿瘤区域阳性评分（TAP，≥5%为阳性阈值之一）。充分评估需要至少100个活肿瘤细胞和5条活检样本。
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  胃腺癌（包括食管和胃食管结合部腺癌）
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    应常规检测HER2、PD-L1、MMR和CLDN18.2。HER2评估采用Hofmann评分系统（3+为阳性，2+需荧光原位杂交（FISH）或显色原位杂交（CISH）验证）。PD-L1可采用CPS和TAP评分。MMR状态通过免疫组化检测MLH1、PMS2、MSH2、MSH6蛋白。CLDN18.2阳性定义为≥75%的肿瘤细胞呈中-强膜染色（完整、基底外侧或外侧）。充分评估HER2和CLDN18.2需要至少5-6条活检样本，PD-L1和MMR需要至少100个肿瘤细胞。
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    FGFR2b是潜在靶点，相关治疗药物正在研发中。
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  小肠腺癌
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    作为一种罕见肿瘤，其生物标志物数据有限。应检测dMMR/MSI状态（阳性率约11%），因其可能从免疫治疗中获益。HER2阳性率约8%，亦有证据支持靶向治疗有效。二代测序（NGS）可用于寻找BRAFV600E突变、KRAS突变、POLE/POLD1突变、RET/NTRK融合及高肿瘤突变负荷（TMB）等其他可干预的基因改变。
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  结直肠腺癌
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    转移性结直肠癌应常规检测MMR/MSI、HER2，并进行KRAS（外显子2、3、4）、NRAS（外显子2、3、4）和BRAF（外显子15）的分子检测。MMR检测是所有结直肠癌诊断时林奇综合征筛查的一部分。dMMR/MSI状态对局部肿瘤预后判断和晚期肿瘤免疫治疗选择至关重要。RAS（KRAS/NRAS）野生型是使用抗EGFR单抗（如西妥昔单抗、帕尼单抗）的先决条件。KRASG12C突变是新兴的靶点。BRAFV600E突变是预后不良因素，其抑制剂（如恩科拉非尼）联合西妥昔单抗在二线及以后治疗中显示出生存获益。
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    在条件允许时，可采用多基因NGS检测以发现更多靶点，如ERBB2扩增、NTRK/RET融合、POLE突变和高TMB等。

4. 分子分析与细胞学样本

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  分子检测（如PCR、NGS）的成功高度依赖于样本质量。建议从高非肿瘤成分的样本中进行显微切割或大块切割，以获得肿瘤细胞比例不低于20%的DNA。DNA质量（如DIN）直接影响分析性能。
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  细胞学样本（如细胞块）是组织样本的有效补充，可用于HER2、MMR和CLDN18.2等免疫组化检测。合理的策略是将细胞块优先用于组织学分型和免疫组化检测，而将细胞涂片用于分子分析。

总结

精准医学的发展使得个性化治疗成为可能。在胃肠道肿瘤，尤其是晚期/转移性疾病的诊疗中，病理学家肩负着利用有限的小活检样本进行精准诊断和生物标志物分型的重任。这要求我们必须采取“审慎”的态度，遵循基于循证医学的指南和标准操作流程，尤其要重视从样本获取、处理到报告的全流程质量管理，确保每一个步骤都达到“充分性”标准，从而为患者提供最准确、最及时的治疗决策依据。