《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design, synthesis and biological evaluation of (±)-kusunokinin derivatives as potent anticancer agents
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本文报道了研究人员针对二苄基丁内酯骨架的抗癌先导化合物Kusunokinin，系统性地设计并合成了22种新型(±)-kusunokinin衍生物，并评估其抗癌活性。研究表明，化合物13、16、18和33对胆管癌（KKU-M213）、三阴性乳腺癌（MDA-MB-231）和ER阳性导管癌（MCF-7）细胞株展现出显著的细胞毒性，同时对正常细胞毒性较低。其中化合物33的活性尤为突出，在MCF-7细胞中的抑制效果比原化合物高出10倍以上。该研究阐明了R位芳氧基/苯基取代与R'位羟基对活性的关键贡献，并探索了这些化合物与潜在靶点CSF1R和AKR1B1的结合模式，为开发基于二苄基丁内酯骨架的新型靶向抗癌药物提供了重要的结构-活性关系（SAR）见解和优化方向。
癌症，作为全球范围内最致命和最常见的慢性疾病之一，其治疗一直是医学研究的前沿阵地。传统的化疗、手术、放疗等方法虽然在对抗癌症方面取得了一定成效，但常常伴随着耐药性、严重的副作用以及难以克服的复发问题。因此，开发更有效、更具靶向性的新型抗癌药物，是科学家们孜孜以求的目标。自然界常常是创新药物的宝库，许多天然产物因其独特的结构和强大的生物活性而备受关注。Kusunokinin就是这样一种从植物中发现的天然产物，它拥有一个核心的二苄基丁内酯结构，并且已经被证实对多种癌细胞，特别是乳腺癌、卵巢癌和胆管癌细胞，具有令人瞩目的抗癌活性。然而，天然产物的来源有限，其抗肿瘤的具体作用机制也尚未完全明晰，这限制了它的进一步开发和应用。为了深入挖掘这一骨架的潜力，改善其药效，并最终揭示其作用的分子靶点，研究人员踏上了对Kusunokinin进行系统性结构改造的探索之旅。这项研究旨在回答一个核心问题：如何通过对Kusunokinin进行化学修饰，获得活性更高、选择性更好的抗癌候选药物？其成果发表于权威期刊《European Journal of Medicinal Chemistry》。
为了开展这项研究，研究人员采用了多学科交叉的研究策略。在化学合成方面，他们设计并合成了22个(±)-kusunokinin衍生物，其核心是使用(±)-中间体9和12作为关键砌块，并巧妙引入了羟基的保护与去保护策略（如使用苄基和三异丙基硅基作为正交保护基），以实现芳香环上特定羟基的选择性官能化。在生物学评价方面，研究团队采用MTT法评估了所有合成化合物对多种癌细胞系（ER阳性导管癌MCF-7、三阴性乳腺癌MDA-MB-231、卵巢癌A2780、胆管癌KKU-M213）和正常成纤维细胞（L929）的细胞毒性。对于筛选出的高活性化合物（13、16、18、33），进一步利用Western blot技术分析了它们对潜在靶蛋白CSF1R和AKR1B1表达水平的影响。此外，还通过分子对接模拟，初步探讨了衍生物与CSF1R和AKR1B1这两个蛋白靶点的相互作用模式，以从计算角度理解其构效关系。
1. 研究背景与化合物设计
近年来，(-)-kusunokinin作为一种从黑胡椒等植物中分离的天然二苄基丁内酯化合物，因其对MCF-7乳腺癌细胞表现出良好的抑制活性而受到关注。随后的研究合成了其消旋体(±)-kusunokinin，并发现其活性与天然产物相当。进一步的结构修饰产生了衍生物TTPG-A和TTPG-B，后者显示出更强的广谱抗癌活性。这些发现暗示芳香环上的羟基取代基可能是其抗癌活性的关键。此外，之前的计算和实验研究指出，集落刺激因子1受体（Colony Stimulating Factor 1 Receptor， CSF1R）和醛酮还原酶家族1成员B1（Aldo-Keto Reductase Family 1 Member B1， AKR1B1）可能是kusunokinin作用的潜在靶点。基于这些前期工作，本研究旨在系统性地探究kusunokinin的结构-活性关系（Structure-Activity Relationship， SAR），以设计出更具潜力的抗癌衍生物。研究人员共设计了22个(±)-kusunokinin衍生物（编号10–27， 31， 33， 35， 37），重点考察芳香环上R、R′和R″位置的取代基效应。如图2所示的通用结构，研究团队在R和R′位点引入了代表氢键供体、氢键受体、芳香π体系和亲脂性基团等多种官能团，包括烷氧基、苯基、酯基、羧酸、酰胺和卤素等。同时，还通过对比化合物31、33与已知化合物MUTTKD和TTPG-A，系统评估了R″位甲氧基的作用。为了探究R′位羟基作为氢键供体和受体的双重作用，还合成了含氟取代基（作为氢键受体）的化合物35和37用于比较。
2. 合成化学
为了高效构建目标分子，研究人员采用了Ganeshpure合成路线及其改进方法。通过使用香草醛作为起始原料，经过羟基保护、Stobbe缩合、氢化、区域选择性还原和环化等关键步骤，成功构建了关键的(±)-中间体9。如方案2所示。该中间体随后通过去保护、烷基化（如与1-溴-2-甲基丙烷、溴乙酸甲酯、4-氟苄基氯等反应）、水解、酰胺化等一系列转化，成功制备了衍生物10–18。类似地，从中间体12出发，通过类似的反应序列合成了衍生物19–27。而为了研究R″位甲氧基和R′位氟取代的影响，化合物31、33、35和37则通过更直接的Ganeshpure途径独立合成。
3. 细胞毒性评价
通过MTT法评估了所有22种新合成衍生物的细胞毒性。结果显示，四种化合物（13、16、18和33）对测试的癌细胞系（MCF-7， MDA-MB-231， A2780， KKU-M213）表现出强效抑制活性，同时对正常L929细胞的毒性较低，显示出潜在的治疗窗口。50) values of trans-(±)-kusunokinin and its derivatives.">如表2所示，其中化合物33对MCF-7细胞的抑制活性是原(±)-kusunokinin的10.06倍，是TTPG-A的6.43倍，TTPG-B的11倍。化合物16对MDA-MB-231细胞的抑制活性更是比原化合物和已知衍生物高出91至607倍。此外，大多数衍生物对KKU-M213胆管癌细胞都有抑制作用，表明这类化合物具有广谱抗癌潜力。
4. 取代基对抗癌活性的影响
通过对细胞毒性的结构-活性关系分析，研究人员得出以下关键结论：首先，R′位含有羟基的衍生物（如表2条目5， 7–13， 24）普遍比不含羟基或羟基在R位的衍生物活性更高，表明该位置的羟基作为氢键供体在抑制机制中扮演关键角色。其次，在R位引入烷氧基链（如化合物13、17、33）或苯环（如化合物12、16、18）能显著提高细胞毒性，这暗示结合位点R位附近可能存在一个亲脂口袋或需要π-π相互作用。最后，将R′位的羟基替换为氟原子（氢键受体）会导致活性显著下降（对比化合物33与35、37），进一步证实了R′位氢键供体的重要性。关于R″位的甲氧基，研究结果存在不一致性，其具体作用有待进一步探究。
5. Western blot分析
为了探究活性化合物的作用机制，研究人员选取了13、16、18、33这四种高活性衍生物，利用Western blot技术检测它们对KKU-M213细胞中CSF1R和AKR1B1蛋白表达水平的影响。如图3所示，与阳性对照pexidartinib类似，(±)-kusunokinin能显著降低CSF1R的蛋白水平。然而，尽管四种衍生物具有更强的细胞毒性，却未能显著下调CSF1R或AKR1B1的蛋白表达。这一结果表明，这些高活性衍生物可能并非通过下调靶蛋白表达，而是通过抑制其激酶活性（如阻碍磷酸化）或作用于其他酪氨酸激酶受体来发挥抗癌作用。同时，这些衍生物有降低AKR1B1蛋白水平的趋势，提示它们可能作为功能性抑制剂直接干扰其酶活性。
6. 分子对接研究
为进一步理解衍生物与潜在靶点的相互作用，研究人员对活性化合物进行了分子对接研究，以(±)-kusunokinin为参照。对接验证实验证实了所用方法的可靠性。如图4， pexidartinib与CSF1R的对接构象与其实验晶体结构高度吻合。对接结果显示，对于CSF1R，没有衍生物的对接评分超过原(±)-kusunokinin或已知抑制剂pexidartinib，评分最高的(+)-12也仅为-10.27 kcal mol-1。分析发现，CSF1R的结合口袋较为狭窄，(-)-kusunokinin能像pexidartinib一样深入其中，而(+)-kusunokinin和(+)-12的某些结构修饰可能阻碍了其进入口袋的深度，导致结合亲和力下降。如图7所示。对于AKR1B1，(-)-kusunokinin的对接评分（-10.62 kcal mol-1）高于已知抑制剂epalrestat（-8.51 kcal mol-1）。值得注意的是，化合物12、16和18表现出比原化合物更高的对接评分，其中(+)-16评分最高（-12.01 kcal mol-1）。分析表明，在R位引入芳香酰胺基团（如16）能带来额外的π-π相互作用（与Trp219），这可能增强了与AKR1B1的结合。如图8所示。然而，对接研究也表明，更高的对接评分并不一定转化为实验上更强的靶蛋白抑制效果，这可能与化合物的结合动力学、水溶性以及其可能作用于其他激酶靶点有关。
研究结论与意义
本研究成功设计、合成并评估了一系列新型(±)-kusunokinin衍生物的抗癌活性。通过引入正交羟基保护与去保护策略，建立了一个高效合成二苄基-γ-丁内酯类似物的平台。细胞毒性测试发现，在R′位含有羟基，同时在R位连接烷氧基链或苯环的衍生物（如13、16、18、33）表现出最优的抗癌活性和对正常细胞的选择性，揭示了关键的构效关系：R′位的氢键供体（羟基）和R位的亲脂/π-相互作用基团对活性至关重要。机制研究表明，虽然原化合物能下调CSF1R蛋白表达，但高活性衍生物可能通过抑制激酶活性而非下调蛋白表达来发挥作用。分子对接为理解这些修饰如何影响与CSF1R和AKR1B1的结合提供了结构层面的见解。值得注意的是，实验活性与计算预测之间存在差异，这提示这些衍生物可能作用于其他激酶靶点，而非仅局限于CSF1R和AKR1B1。
本研究的重大意义在于，它不仅发现了数个活性显著优于先导化合物的新衍生物（尤其是化合物33和16），为开发基于二苄基丁内酯骨架的高效、选择性抗癌药物提供了明确的优化方向和极具潜力的候选分子；更重要的是，它通过系统的构效关系分析和初步机制探索，深化了对该类化合物作用模式的理解，尤其是揭示了其可能作为多靶点激酶抑制剂的潜力，为后续针对癌症相关激酶的理性药物设计奠定了坚实的化学与生物学基础。
