《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》：Magnetic immunoprecipitation assay for the isolation of adalimumab and degradation products in preclinical biological samples
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本研究针对临床前药代动力学(PK)评估中，治疗性单抗(mAbs)从复杂生物基质（如大鼠血清）中特异性分离和回收的难题，开发了一种基于R10抗人IgG1抗体偶联磁珠(R10-coupled Dynabeads)的免疫沉淀(IP)法。该方法成功从大鼠蛋白混合物中高效、高特异性地分离出模型药物阿达木单抗(AdmAb)及其化学氧化(AAPH/H2O2)和物理搅拌胁迫产生的降解产物，回收效率高且交叉反应性低。结合LC-MS/MS分析，该方法能捕获氧化修饰位点（序列覆盖率≥90%），并可应用于评估AdmAb的药代动力学(PK)参数。该工作流程为研究治疗性蛋白在体内的稳定性及修饰提供了一种高效、高特异性的新工具。
治疗性单克隆抗体(mAbs)作为一类重要的蛋白质药物，在肿瘤、自身免疫性疾病等多种疾病的治疗中发挥着至关重要的作用。然而，这类大分子药物的开发并非一帆风顺。在临床前研究阶段，尤其是在动物模型（如大鼠）中进行药代动力学(PK)评估时，研究人员面临着一个共同的挑战：如何将注射给人源或人源化单抗从动物体内复杂的生物基质（如含有大量宿主蛋白的血清）中高效、特异地“找出来”并进行准确定量？这不仅是为了绘制精确的血药浓度-时间曲线，更是为了评估药物在体内环境中可能发生的化学修饰（如氧化、脱酰胺等），这些修饰可能直接影响药物的疗效、安全性甚至免疫原性。传统的分离方法往往在特异性、所需样本量或操作繁琐程度上存在局限。因此，开发一种高效、高特异性且适用于分析药物降解产物的新方法，对于推进治疗性单抗的临床前开发至关重要。
基于此，来自堪萨斯大学等机构的研究团队在《European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics》上发表了一项研究。他们巧妙地利用了免疫沉淀的原理，将一种高特异性的小鼠抗人IgG1抗体（克隆R10Z8E9）偶联到Dynabeads?磁性微珠上，构建了R10-coupled Dynabeads。这项研究的核心，是评估该磁珠免疫沉淀法在分离模型药物阿达木单抗（一种抗肿瘤坏死因子α的人源IgG1单抗，Humira?的生物类似药）及其经过胁迫产生的降解产物方面的性能，并将其应用于大鼠体内的药代动力学研究。
研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，通过化学偶联将R10抗体固定到磁珠上。其次，利用优化的免疫沉淀流程，从加标的大鼠血清或体内采集的血浆/组织中捕获目标蛋白。第三，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合SYPRO? red染色和光密度分析，对回收的蛋白进行定量和纯度评估。第四，利用动态光散射(DLS)和背景膜成像(BMI)技术，分析样品中的纳米级和微米级聚集体。第五，对回收的蛋白进行Trypsin/Lys-C酶解，并使用四级杆飞行时间液质联用仪(QToF LC-MS/MS)进行肽段分析，以鉴定氧化修饰位点并计算序列覆盖率。最后，将方法应用于从给予单次静脉(IV)或皮下(SC)注射AdmAb的Wistar-Han大鼠（样本来源于Charles River）中采集的系列血浆样本，通过非房室模型分析计算药代动力学参数。
3.1. 从大鼠血清中回收阿达木单抗
通过比较三种不同的抗人IgG磁珠产品，研究人员发现R10-coupled Dynabeads在从大鼠血清中回收AdmAb方面表现出最高的回收效率（约99%）和最低的非特异性结合（<5%）。还原性SDS-PAGE显示，磁珠能有效捕获AdmAb的重链和轻链，而几乎不结合大鼠宿主蛋白，证实了其高特异性。
3.2. 评估R10-coupled Dynabeads对阿达木单抗的回收效率、特异性和结合容量
通过改变磁珠用量，研究人员确定了回收10 μg AdmAb的最优磁珠量为2.5 mg，此时既能实现接近完全的回收，又能保持样品的高纯度。这一结论得到了SDS-PAGE和LC-MS/MS通过监测AdmAb特征肽段(m/z 713.68)与大鼠血清特征肽段(m/z 530.98)强度比的一致支持。
3.3. 阿达木单抗氧化残基的鉴定
使用AAPH和H2O2对AdmAb进行强制氧化后，LC-MS/MS分析（序列覆盖率约90%）鉴定出四个甲硫氨酸(Met, M)残基被氧化为甲硫氨酸亚砜，主要位于Fc区的CH2域(M256)和CH3域(M432)，以及Fab区的可变区(M34, M83)。其中，位于Fc区表面暴露的M256氧化程度最高。
3.4. R10-coupled Dynabeads不改变阿达木单抗及其氧化变体的氧化状态
实验证明，在标准的45分钟回收孵育时间内，R10-coupled Dynabeads不会导致AdmAb发生额外的氧化。同时，对于预先氧化的AdmAb变体，经过磁珠回收后，各氧化位点的归一化强度保持不变，说明氧化修饰并未影响R10抗体对其表位（CH2域）的结合。
3.5. R10-coupled Dynabeads从体外和体内大鼠蛋白混合物中回收强制氧化的阿达木单抗
无论是体外将氧化AdmAb加标到大鼠血清，还是体内给大鼠注射氧化AdmAb后采集血浆或皮下组织裂解液，R10-coupled Dynabeads对氧化变体的回收效率均与未氧化的原生AdmAb相当。这表明，在所用氧化条件下，氧化修饰没有破坏R10抗体所识别的表位。
3.6. R10-coupled Dynabeads能回收阿达木单抗的聚集物种，但也会诱导更多聚集形成
通过搅拌胁迫诱导AdmAb产生聚集体后，R10-coupled Dynabeads能够回收这些聚集物种。然而，DLS和BMI分析发现，磁珠回收过程本身会诱导额外的纳米级和微米级聚集体形成，特别是在预先经过搅拌胁迫的样品中。对于化学氧化的样品，仅在AAPH氧化样品中观察到少量二聚体，且磁珠处理会轻微增加微米级聚集颗粒的数量。
3.7. R10-coupled Dynabeads可用于研究阿达木单抗的药代动力学
应用该方法处理大鼠给药后的血浆样本，成功绘制了AdmAb经IV和SC给药后的血药浓度-时间曲线。非房室模型分析显示，SC给药的达峰时间(Tmax)为3天，生物利用度(F)为40.7%，总体清除率(CL)与已报道研究结果具有可比性。SC给药组在给药后期（第11、14天）观察到的血药浓度异常下降，可能与大鼠体内产生抗药物抗体(ADA)有关。
该研究成功建立并验证了一种基于R10-coupled Dynabeads的磁珠免疫沉淀法。该方法能够高效、高特异性地从临床前大鼠生物基质中分离人源IgG1治疗性单抗（以AdmAb为例）及其化学氧化降解产物，前提是这些降解产物保留了R10抗体所识别的表位。该方法所需样本量小（≤15 μL血浆），结合SDS-PAGE定量、Trypsin/Lys-C酶解和QToF LC-MS/MS分析，能实现高序列覆盖度（≥90%），并成功应用于药代动力学研究，所得PK图谱与已报道方法（如ELISA）基本一致。
在讨论部分，作者深入阐释了该方法的优势与潜在局限。其高特异性源于R10抗体对人与大鼠IgG的精确区分能力。研究确认了甲硫氨酸是AdmAb在AAPH和H2O2氧化下的主要靶点，且位于Fc区表面暴露的M256最易被氧化，这与文献报道一致。该方法能有效回收氧化变体，证明这些修饰未影响抗体结合。然而，研究也明确指出该方法的局限性：对于物理胁迫诱导的聚集体，磁珠分离过程本身会加剧聚集，这可能影响对预先聚集样品的准确分析。此外，方法的成功应用完全依赖于目标蛋白上R10表位的完整性与可及性，如果体内修饰破坏或遮蔽了该表位，则可能导致回收不全。
该研究发展的集成化工作流程意义重大。它不仅为临床前单抗药代动力学研究提供了一种可靠的新工具，更重要的是，它使得直接评估治疗性蛋白在体内真实环境下发生的化学修饰（如氧化）成为可能。这对于理解关键质量属性(CQAs)与体内稳定性、生物利用度及疗效之间的构效关系至关重要，能为制剂与工艺开发提供关键信息，并增强体内稳定性评估的转化相关性。未来，该方法可用于研究氧化修饰对SC给药生物利用度的影响，或通过组合针对不同表位的抗体，以最大化回收体内各种可能的降解产物。
