水稻中的抗生素抗性基因（ARGs）：来源追溯及潜在的迁移模式

《Food Microbiology》：Antibiotic Resistance Genes (ARGs) in Rice: Source Attribution and Putative Mobility Patterns

抗生素耐药基因在水稻籽粒及环境中的分布特征与传播机制研究。通过shotgun metagenomics分析籽粒、种子、叶、茎、根及土壤、灌溉水等环境样本，发现籽粒携带395种ARG亚型，与种子（290种）和环境样本（322种）存在显著重叠，但环境来源对籽粒耐药基因库贡献度更高（20.68% vs 49.49%）。通过MAG重构和系统发育分析，鉴定出11种VGT-like和28种HGT-like基因传播模式，揭示种子携带和环境输入对水稻耐药基因库的双重影响。

　　

Jie Hou|Ye Li|Mengqi Liu|Linyun Li|Hongan Chen|Yi An|Han Xu|Yanpo Yao

临沂大学农林科学学院，中国临沂276000

摘要

水稻籽粒可能携带抗生素抗性基因（ARGs），但种子相关和环境储存库的相对作用仍不清楚。我们对水稻组织（籽粒、种子、叶片、茎、根）及其周围环境（土壤、灌溉水、雨水、PM₁₀）进行了鸟枪法宏基因组学分析。共检测到1,019种ARG亚型；其中籽粒中含有395种，这些亚型与种子（290种）和环境样本（322种）有大量重叠。FEAST源追踪显示了不同的归属模式：种子来源解释了近一半的籽粒微生物组（平均49.49%），而环境来源对籽粒抗性组的贡献较低（8.45%）。重建了747个宏基因组组装基因组（MAGs），其中包括275个携带ARG的MAGs。系统发育分析识别出39种在样本间几乎完全相同的ARG关联，并根据宿主一致性（相同或不同预测宿主）将其分为11种可能的VGT型和28种可能的HGT型。例如，籽粒和种子中的bla_GOB-50在Elizabethkingia anopheles中具有几乎相同的序列（VGT型），而籽粒中的APH(9)-Ic（Burkholderia）与PM₁₀（Comamonas）匹配，符合HGT型关联。在某些情况下，ARG与移动基因（MGE）的共定位（如umuC、cca）进一步支持了这种移动性。总体而言，这些结果表明籽粒微生物组中存在种子传播的ARG特征，但籽粒抗性组与环境有更强的关联，这为追踪水稻系统中的ARG储存库提供了线索。

引言

水稻（Oryza sativa L.）是全球超过一半人口的主食（Cordero-Lara, 2020）。然而，抗生素耐药细菌（ARB）和抗生素抗性基因（ARGs）作为新的污染物，对其卫生质量和安全构成了重大威胁。越来越多的证据表明水稻生态系统中存在大量ARGs。例如，Zhou等人（2019）在水稻和小麦的叶际层中检测到了162种ARGs。类似地，Kang等人（2024）在根际土壤、根部和籽粒中发现了四环素抗性基因，并在可食用籽粒中发现了多种耐药细菌。此外，从水稻中分离出携带β-内酰胺酶基因的人类机会性病原体，这些病原体表现出对氨苄西林的耐药性（Maina等人，2021）。尽管在多个地区的水稻籽粒中越来越多地报告ARGs的存在，但其相关的健康风险仍研究不足。一个可能的原因是水稻在食用前通常会经过烹饪，这可能减少了活细菌的数量（Kang等人，2024）。然而，烹饪在多大程度上减轻了ARGs和ARBs的相关问题仍不清楚。值得注意的是，某些内生细菌（如形成孢子的细菌，如Bacillus）在某些条件下能够耐受高温处理，包括高于90°C的温度（Nakagawa等人，1998）。由于这些细菌在多种环境中被报道为ARG的宿主，它们的持续存在可能代表了一种潜在但尚未充分研究的暴露途径（Sundin和Wang，2018；Chang等人，2024；Ransirini等人，2024）。这些观察结果促使人们进一步研究水稻生产系统中的ARG污染及其潜在储存库。

为了解决粮食作物（特别是水稻）中的ARG污染问题，首先需要识别和了解水稻籽粒中ARGs的来源。在蔬菜系统中的广泛研究表明，粪肥和土壤是外源性ARGs的主要来源（Mei等人，2021；Sun等人，2021）。此外，空气和雨水中的细菌也是植物地上部分的微生物组的重要组成部分（Zhou等人，2020）。最近的一项关于水稻的研究发现，施肥增加了土壤和根部的ARGs含量，但并未显著改变籽粒中的ARGs谱型（Xu等人，2024）。这意味着ARGs在籽粒中的积累和传播可能与叶类蔬菜中的模式不同，可能受到水稻种植方式和淹水条件的影响。然而，关于水稻籽粒中ARGs来源的全面研究仍存在明显不足，这是实施有效控制和解决粮食作物中ARG污染措施的关键前提。

因此，我们使用鸟枪法宏基因组学研究了水稻生产系统中ARGs的潜在来源和跨组分关联。我们采集了水稻组织（种子、根、茎、叶片、籽粒）和环境样本（土壤、PM₁₀、灌溉水、雨水），分析了微生物组和抗性组谱型，并应用源追踪方法估计了它们对籽粒群落的贡献。为了进一步了解与籽粒相关的ARGs，我们重建了宏基因组组装基因组（MAGs），并筛选了基于高核苷酸同一性的ARG序列以识别潜在的关联。根据宿主一致性，将这些关联操作性地分类为可能的VGT型或HGT型，从而提供了关于ARG传播的宿主信息。总体而言，我们的结果为追踪水稻系统中的ARG储存库和优先采取缓解措施提供了依据。

田间水稻种植和样本采集

为了研究水稻籽粒中ARGs的来源，在中国湖南省进行了田间实验。水稻种植（2023年3月至7月）在农业部农村事务部湘潭实验站的试验田进行，该试验站位于湖南省湘潭市。选择了在中下游长江流域广泛种植的早季水稻品种ZhongZao35（Oryza sativa L.）

水稻及相关环境样本中ARG组成的特征

在所有样本类型中，共检测到1,019种能够抵抗28种抗生素家族（如氨基糖苷类、β-内酰胺类、多重耐药类、喹诺酮类和万古霉素类）的ARG亚型，其相对丰度范围为每细胞10^-5至10^-1个拷贝（图1a-b）。在ARG亚型水平上，杆菌肽抗性基因bacA（0.37±0.34拷贝/细胞）的丰度最高，其次是多重耐药基因mdtK（0.21±0.25拷贝/细胞）和msbA（0.18±0.21拷贝/细胞）

水稻籽粒中ARGs的广泛存在引发了潜在的食品安全问题

我们的研究强调了水稻籽粒样本中多样且丰富的ARGs。水稻籽粒中的总ARG负担为每细胞7.47 ± 1.79个拷贝。在检测到的395种ARG亚型中，每种亚型的丰度范围为每细胞10^-6至10^-1个拷贝。尽管单个亚型的数量通常较低，但它们的累积丰度导致了总体负担较高。这些数值与水稻（Kang等人，2024）、小麦（Shen等人，2023）等作物以及蔬菜中的ARG丰度相当

CRediT作者贡献声明

Hongan Chen：方法学、概念化。Yi An：监督、资源提供。Han Xu：写作 – 审稿与编辑、监督、资金获取、正式分析。Jie Hou：写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、软件使用、方法学研究、资金获取。Ye Li：验证、方法学研究。Mengqi Liu：软件使用、方法学研究。Linyun Li：软件使用、方法学研究。Yanpo Yao：监督、资源提供

资金来源

本研究得到了国家自然科学基金（编号42307543和42507591）、中央公益性科学事业单位基础研究基金（1610022024010）以及山东省自然科学基金（编号ZR2023QD008）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。