《Forensic Science International: Genetics》：An Evaluation of Molecular and Statistical Methods for the Attribution of Body Fluid Sources to Donors
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利用mRNA的cSNPs进行生物材料来源归属的可行性研究，通过Illumina MiSeq测序结合PCA和贝叶斯网络分析，发现对血液和阴道样本效果显著，但唾液和皮肤样本因测序质量受限，捐赠者关联能力不足。
作者：阿妮卡·尼娜·科雷尔·特恩卡（Anika Nina Correll Trnka）、丽贝卡·理查兹（Rebecca Richards）、斯蒂芬妮·奥珀曼（Stephanie Opperman）、莎莉安·哈比森（SallyAnn Harbison）
新西兰奥克兰大学怀帕帕陶马塔劳分校（Waipapa Taumata Rau）化学科学学院
摘要
在法医学中，将犯罪痕迹中的混合生物材料归因于具体捐赠者仍然是一个挑战。通过分析生物材料中的信使RNA（mRNA）转录本，可以用于体液鉴定（Body Fluid Identification, BFID）。将犯罪痕迹中获得的mRNA转录本中的编码区单核苷酸多态性（cSNPs）与已知个体的参考cSNP谱进行比较，可以确定这些生物材料的来源。
本研究收集了11名参与者的唾液、血液、皮肤和阴道样本。基于先前的研究，设计了一种针对单源gDNA和RNA样本中23个cSNPs的测序方法，以评估Illumina MiSeq测序技术在BFID和捐赠者关联方面的应用潜力。
初步研究取得了有希望的结果。RNA样本显示出了与其来源生物材料相符的表达模式。利用主成分分析（PCA）对表达结果进行了分析，并将其纳入贝叶斯网络（BN）中进行统计解释，获得了令人鼓舞的结果。尽管cSNPs的变异检测取得了一定的成功，但某些RNA转录本的区分能力和测序质量限制了捐赠者识别的可能性，尤其是对于唾液和皮肤样本。
引言
在混合生物材料中区分体液与其对应捐赠者仍然具有挑战性，尽管这种混合物在法医案例中很常见[1]。目前，体液鉴定（BFID）和DNA分析是独立的测试，其结果可能并不相关[2]、[3]。即使对于看似来自同一来源的样本，也可能出现“关联谬误”，即错误地将样本中检测到的生物材料认定为DNA谱的来源[4]。例如，体液检测的灵敏度可能高于DNA检测，因此即使没有获得沉积体液的个体的DNA谱，也可能得到阳性结果[5]、[6]、[7]。假设一个混合痕迹中，一部分血液由个体一沉积，另一部分皮肤细胞由个体二沉积。如果从该痕迹中获得的DNA谱与个体二匹配，并且常规检测显示为血液阳性，那么可能会错误地认为该DNA谱来自血液[7]。细胞类型之间RNA含量的差异和丰度差异可以被利用，通过检测特定于液体和组织的RNA表达来识别具有法医意义的生物材料[2]、[8]、[9]。本研究采用了大规模并行测序（MPS）技术，如Illumina MiSeq和Ion Torrent平台，对信使RNA（mRNA）标记进行靶向测序[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。mRNA转录本中的序列变异（如编码区单核苷酸多态性cSNPs）可以与相应的DNA分子变异相对应，从而将mRNA转录本及其来源生物材料与DNA捐赠者关联起来[15]。概率方法是解释和报告法医结果的首选方法，例如似然比（LR），通常用语言等级来表示[8]、[16]。可以使用贝叶斯网络（BN）或其他概率框架来评估来源和活性水平的命题[17]、[18]、[19]。BN可以结合DNA和BFID证据来评估体液与捐赠者的关联，但目前这种应用主要基于假设性的测试证据[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。
本研究的主要目的是验证先前研究[26]、[27]、[28]中将生物材料归因于特定捐赠者的结果的可重复性，评估该检测方法的区分能力（PD），并将结果整合到BN中进行来源级别的评估。由于最初发表研究中使用的商用多重PCR试剂盒已不再生产，且相关引物序列也无法获得，因此开发了新的方法。
材料与方法
本研究基于Ingold等人的研究[27]。由于Ingold等人使用的TruSeq? Custom Amplicon Assay和Targeted RNA Assay（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）已停止生产，因此开发了一种自定义的测序流程。2023年5月18日，我们从奥克兰健康研究伦理委员会（AHREC；参考编号AH25808）获得了收集最多20名参与者生物材料的伦理批准。所有参与者均签署了书面知情同意书。
生物信息学处理
本研究使用了Subread包（v2.0.6 [43]、[44]）。
贝叶斯网络（BN）构建
Taylor等人[52]概述了构建用于处理活性水平命题的BN的七步流程。为了使用BN和此处描述的方法处理来源级别的命题，我们构建了一个简化的四步模型，该模型使用了Hugin（v9.5；
www.Hugin.com）[20]、[24]、[52]、[53]（图1）。BN包含每个目标基因（
AMICA1、ANK1、CD3G、CD93、SPTB、MUC7、PRB3、CYP2A7、DKK4、COL17A1、KRT77和
LCE1C）的节点，以及一个表示生物材料概率的节点。
测序结果
在测序准备过程中，一个RNA阴道样本（1VSb）因样本管损坏而丢失，一个RNA皮肤样本（11SKb）和RNA ENEG对照样本在测序阶段失败。剩余的RNA样本包括9名参与者的18份血液样本、11名参与者的22份唾液样本、10名参与者的19份皮肤样本以及4名参与者的7份阴道样本。所有样本都进行了适当的对照测序，除非出现特殊情况，否则均产生了预期的结果。结论
本研究展示了利用RNA序列数据辅助体液鉴定（BFID）和生物材料捐赠者关联的潜力，特别是对于血液和阴道样本。RNA与目标基因的对齐以及结合PCA和BN的统计分析显示出了有希望的结果。在当前阶段，该检测方法可以用于单源生物材料的捐赠者关联，尤其是血液和阴道样本。由于本研究属于概念验证性质
资金来源
本研究得到了新西兰商业、创新与就业部授予新西兰公共卫生与法医学研究所的战略科学投资基金的支持。作者贡献声明
丽贝卡·理查兹（Rebecca Richards）：撰写、审阅与编辑、方法学设计。斯蒂芬妮·奥珀曼（Stephanie Opperman）：撰写、审阅与编辑、监督。莎莉安·哈比森（SallyAnn Harbison）：撰写、审阅与编辑、监督、项目管理、资金筹集、概念构思。阿妮卡·尼娜·科雷尔·特恩卡（Anika Nina Correll Trnka）：撰写、审阅与编辑、初稿撰写、方法学设计、数据分析、概念构思。利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。致谢
本研究由阿妮卡·科雷尔·特恩卡在奥克兰大学怀帕帕陶马塔劳分校攻读法医学硕士学位期间完成。感谢Olivia Martin、Courtney Lynch和Richard Wivell对手稿提出的宝贵意见。同时感谢Ryan England和Liam Barry在实验室工作方面的协助，以及Janet Stacey在数据分析方面的支持。
