没食子单宁通过调节电子传递链（ETC）途径，改善了过氧化氢对绵羊卵母细胞造成的损伤

《Free Radical Biology and Medicine》：Myricetin ameliorates hydrogen peroxide-induced impairment in sheep oocytes via regulation of the electron transport chain (ETC) pathway

氢过氧化物诱导的绵羊卵子氧化损伤通过线粒体电子传递链调控，Myricetin通过增强ETC活性改善卵子体外成熟及胚胎发育。

　　

吴洪凯|尤宝义|高建红|王青|马静晓|程百祥|刘海星

中国延边朝鲜族自治州延边大学农学院，邮编133000

摘要

氧化应激会严重损害体外培养过程中的卵子质量。过氧化氢（H₂O₂）引起的损伤会特异性地破坏线粒体功能，从而影响胚胎的发育能力。本研究探讨了线粒体电子传递链（ETC）在介导没食子素（MYR）对H₂O₂引起的卵子损伤的保护作用中的作用。实验将羊卵子分为四组：对照组、H₂O₂损伤组、MYR干预组以及MYR与ETC抑制剂联合组。经过体外成熟（IVM）处理后，评估了成熟率、细胞内活性氧（ROS）水平、谷胱甘肽（GSH）含量和线粒体膜电位（MMP）等关键指标。通过定量实时PCR（qRT-PCR）和部分蛋白质验证实验，量化了ETC组分（ND1、ND4、CYTB、SDHA、COX1、COX2、ATP6、ATP8）以及与氧化应激、线粒体功能和凋亡相关基因的表达情况。结果表明，H₂O₂暴露显著增加了ROS的积累，降低了GSH含量，损害了线粒体功能，抑制了第一极体的排出，并下调了ETC相关基因的表达，同时激活了凋亡信号通路。相比之下，MYR在特定浓度下能够降低ROS水平，增强抗氧化能力和线粒体活性，稳定线粒体膜电位，上调ETC相关基因，抑制凋亡，并提高卵子的成熟率以及孤雌生殖的分裂和囊胚形成率。综上所述，MYR通过调节ETC途径来增强线粒体功能并减轻卵子的氧化损伤，为优化家畜卵子的体外成熟提供了新的理论基础。

引言

由于卵子具有较大的细胞质体积和丰富的线粒体，在非最佳体外成熟（IVM）条件下，卵子特别容易积累ROS，这使得氧化应激成为研究的重点[1]。ROS水平的升高会破坏促进成熟的因子稳定性，导致减数分裂异常。此外，过量的ROS会产生氧化应激反应，引发多种细胞死亡途径，包括凋亡、自噬和坏死，从而降低IVM过程中的卵子质量[2]。因此，减轻氧化损伤是卵子IVM过程中的关键挑战。

线粒体ETC是细胞中的核心代谢途径，在能量产生和维持正常细胞生理活动中起着关键作用[3]。具体而言，线粒体通过氧化磷酸化生成三磷酸腺苷（ATP），这一过程由ETC驱动，利用葡萄糖等底物提供的能量[4]。在此过程中，电子从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FADH₂）传递给氧气，产生水的同时建立质子梯度以驱动ATP的合成[5]。然而，部分电子会从ETC中泄漏，导致ROS过量生成，进一步引发氧化应激、DNA损伤和线粒体功能障碍，最终导致细胞死亡[6]。鉴于ETC功能障碍在氧化损伤中的核心作用，探索支持ETC完整性的干预措施具有重要意义。

没食子素（MYR），又称没食子醇，化学名为3,5,7,3′,4′,5′-六羟黄酮。作为一种多羟基黄酮化合物，它具有多种生物活性，包括抗癌[7]、抗氧化[8]、抗炎[9]、抗菌[10]和镇痛作用[11]。研究表明，用10 μM的MYR处理猪卵子可以增加第一极体的排出率、分裂率和囊胚形成率，并同时降低细胞内ROS水平[12]。MYR还能通过激活Nrf2/HO-1通路来减轻肾纤维化[13]。此外，在10 μM浓度下，没食子素可以恢复超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性和表达，抑制H₂O₂引起的DNA和脂质损伤，并减少膜脂质过氧化[14]。

然而，目前关于MYR是否通过特异性调节ETC途径来发挥保护作用的研究还较为有限。作为线粒体呼吸链的核心组成部分，ETC功能障碍会直接增加ROS生成并降低ATP合成，从而加剧氧化应激引起的卵子损伤。因此，深入研究MYR通过调节ETC途径来减轻H₂O₂引起的卵子氧化损伤的作用，对于揭示其在IVM过程中的保护机制具有重要意义。这项研究为提高体外培养卵子的质量提供了新的理论基础和潜在的干预靶点。

实验部分

卵子的采集与体外成熟

卵子来自中国延吉市的一家当地屠宰场的小尾汉羊。去除附着的多余组织并彻底冲洗后，从可见的卵泡中抽取卵丘-卵子复合体（COCs），然后在IVM培养基（Bioscience）中多次洗涤以去除体细胞和杂质，将约30个COCs分组，在37.5°C、5% CO₂条件下培养24–26小时以实现成熟。

孤雌生殖激活

用移液器去除卵子的卵丘

建立羊卵子的H₂O₂损伤模型并验证ETC途径活性

为了明确H₂O₂损伤与ETC途径之间的关联，我们首先筛选了最佳的H₂O₂损伤浓度。如表2所示，随着H₂O₂浓度的增加，卵子的第一极体排出率及后续胚胎发育均呈剂量依赖性下降。与对照组相比，50 μM H₂O₂组的卵子并未完全死亡，且损伤效果稳定；因此，确定50 μM为最佳损伤浓度。

讨论

过氧化氢（H₂O₂具有强烈的氧化性，许多研究者利用H₂O₂来建立氧化应激模型。研究表明，通过向猪、鼠和羊的IVM培养基中添加不同浓度的H₂O₂可以成功建立氧化应激模型[[15], [16], [17]]。本研究中，使用50 μM/L的H₂O₂处理羊卵子以建立氧化应激模型。结果显示，ROS水平显著升高，线粒体膜电位（MMP）也明显下降

结论

总之，H₂O₂通过抑制ETC途径和激活Drp1介导的线粒体功能障碍来损害卵子功能，而MYR则通过维持线粒体稳态和增强ETC活性来对抗这些效应。MYR通过减少ROS积累、抑制凋亡以及促进卵子成熟和发育潜力来发挥保护作用。重要的是，MYR的益处完全依赖于完整的ETC途径——这一点在AA条件下得到了验证

作者贡献声明

吴洪凯：撰写原始稿件、软件使用、方法设计、数据管理、概念构建。尤宝义：撰写原始稿件、软件使用、方法设计、数据管理、概念构建。高建红：撰写与编辑。王青：数据可视化、实验分析。马静晓：实验分析、概念构建。程百祥：数据可视化、实验分析。刘海星：实验监督。

利益冲突声明

作者声明没有已知的潜在利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。