《Genes & Diseases》：IRF7-mediated microglia activation exacerbates temporal lobe epilepsy through targeting the neuronal RORB/STIM1 pathway
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为解决药物难治性颞叶癫痫(TLE)的病理机制不清问题，首都医科大学宣武医院的研究人员聚焦神经炎症，深入探究了癫痫灶的细胞微环境。研究首次通过单细胞基因调控网络(GRN)分析，识别出小胶质细胞中的干扰素调节因子7(IRF7)是驱动TLE微环境改变的关键转录调节因子。该研究揭示了IRF7通过核转位释放干扰素-β(IFN-β)，进而抑制神经元中视黄酸相关孤儿受体β(RORB)对抗原反应分子1(STIM1)的转录激活，最终导致神经元损伤与癫痫表型。该成果明确了IRF7作为癫痫神经炎症的核心调控因子，为靶向IRF7的神经保护疗法提供了新策略。
癫痫，作为全球最常见的慢性神经系统疾病之一，影响着数千万人的生活。其中，颞叶癫痫(TLE)是药物难治性癫痫中最常见也最棘手的形式。尽管有标准抗癫痫药物治疗，仍有约三分之一患者发展为耐药性癫痫，而手术切除病灶也仅有约70%的成功率。究其原因，癫痫病灶的病理特征尚未完全阐明，导致手术切除范围难以精准界定，限制了治疗效果的进一步提升。长期以来，癫痫研究多聚焦于神经元自身的兴奋-抑制失衡，而忽视了围绕神经元的细胞微环境，尤其是神经免疫细胞的作用。近年来，神经炎症被认为是癫痫发生发展（癫痫发生）的关键推手。作为中枢神经系统的“常驻”免疫细胞，小胶质细胞通过与神经元及其他胶质细胞的动态相互作用，在加剧或缓解癫痫活动中扮演着“双刃剑”的角色。因此，深入探究癫痫病灶的细胞微环境，识别其中主导的细胞类型和关键的调控分子，对于理解癫痫的发病机制、开发新的治疗靶点至关重要。
既往的单细胞测序研究已经发现癫痫病灶中存在显著的胶质细胞炎症反应，但大多停留在差异表达分析层面，难以从系统层面揭示驱动这些变化的深层基因调控网络(GRN)。常规的群体转录组学方法掩盖了细胞群体的异质性。随着单细胞RNA测序技术的发展，我们得以在单细胞分辨率下解析癫痫灶内不同细胞类型的独特转录特征。为了全面阐明TLE的细胞微环境，需要回答三个基本问题：在细胞层面，哪种细胞类型在应对TLE时表现出最显著的变化？在分子层面，驱动TLE中GRN重构的关键调控因子是什么？在功能层面，受影响的细胞群体发生了何种类型的功能扰动？
正是在这样的背景下，首都医科大学宣武医院神经外科的徐进坤、王轶赫、张华强等研究人员在《Genes 》上发表了一项突破性研究。他们利用单核RNA测序(snRNA-seq)构建了TLE的活化调控网络，结合计算分析和功能实验，首次识别出小胶质细胞中的干扰素调节因子7(IRF7)是驱动TLE微环境改变的关键核心调控因子，并系统阐明了IRF7如何通过促进干扰素-β(IFN-β)释放，损害特定的RORB+神经元，通过抑制RORB-STIM1神经保护轴来破坏神经元稳态，最终导致癫痫表型和海马硬化。
研究人员为开展此项研究，综合运用了多种关键技术方法。首先，他们整合了来自公共数据库(GEO: GSE190452)和自身获得的临床颞叶癫痫患者与正常对照者的脑组织样本（共计24例TLE与10例对照），进行了单核RNA测序与深入的生物信息学分析，特别是应用SCENIC算法进行基因调控网络(GRN)推断和模块分析。其次，建立了海人酸(KA)诱导的小鼠TLE模型，并通过颅内注射腺相关病毒(AAV)实现了小胶质细胞特异性的IRF7敲除。随后，他们利用视频脑电图(vEEG)长期监测、戊四氮(PTZ)诱导的癫痫发作测试以及开放场和新物体识别等行为学实验，系统评估了癫痫表型和相关认知行为改变。在体外，研究者构建了HMC3小胶质细胞系与SH-SY5Y神经元细胞系或原代神经元的Transwell共培养系统，模拟神经元-小胶质细胞相互作用，并通过RNA测序、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹法(Western blotting)、免疫荧光染色、双荧光素酶报告基因检测和染色质免疫沉淀(ChIP)等多种分子生物学技术，深入探究了IRF7的激活机制、下游信号通路及其对神经元功能的影响。
研究结果分为多个部分，每个部分层层递进地揭示了IRF7在TLE中的核心作用：
1. 单核测序描绘TLE细胞微环境图谱
研究人员通过单核RNA测序数据分析，在TLE组织和正常对照脑组织中鉴定出11种主要的细胞谱系。细胞丰度分析发现，尽管TLE组与对照组在少突胶质前体细胞、小胶质细胞和兴奋性神经元比例上存在差异，但均未达到统计学显著性，提示TLE的病理改变可能更多发生在分子和转录组层面，而非细胞组成层面。
2. GRN分析识别出小胶质细胞特异的关键转录调控因子IRF7
通过SCENIC算法进行GRN分析，研究者将所有鉴定出的调节子聚类成18个转录调控网络模块。其中，模块5(M5)显示出显著的转录调控活性，且主要与小胶质细胞相关。进一步的方差分解分析表明，IRF7是解释TLE组间差异和细胞群特异性差异中贡献度最高的调节子，凸显了IRF7在癫痫脑微环境中的核心调控作用。
3. IRF7在TLE中高表达且与癫痫发作频率增加相关
单细胞数据分析和免疫荧光染色证实，IRF7的活性在小胶质细胞中特异性升高，并与小胶质细胞标记物IBA1共定位。临床样本和动物模型的蛋白质印迹及实时定量PCR分析显示，虽然总IRF7蛋白水平不变，但其活性形式磷酸化IRF7(pIRF7)在癫痫组织中显著增加。临床数据分析进一步发现，IRF7高表达的患者每月癫痫发作频率（平均7次）显著高于低表达患者（平均3次）。
4. 敲除IRF7通过逆转小胶质细胞极化减轻癫痫表型
体外共培养实验表明，在模拟TLE的环境（KA处理）下，小胶质细胞被激活并向促炎表型极化（促炎标志物IL-1β、iNOS、TNF-α表达上调，抗炎标志物IL-10、Arg-1、CD206下调），而敲除IRF7能显著逆转这一趋势，抑制其迁移能力。在体实验中，通过AAV实现小胶质细胞特异性IRF7敲除后，小鼠海马区小胶质细胞活化和数量减少，对PTZ诱导的癫痫发作敏感性降低，视频脑电图监测显示自发性复发癫痫发作(SRS)的频率和持续时间均显著减少。
5. RNA测序揭示IRF7介导TLE中的I型干扰素反应激活
对共培养的小胶质细胞进行RNA测序和基因集富集分析(GSEA)发现，在TLE环境下，IRF7的缺失显著减弱了与“I型干扰素反应”和“干扰素-β反应”相关基因的上调。ELISA实验证实，IRF7敲除显著降低了IFN-α和IFN-β的分泌，其中IFN-β的降低更为显著。外源性给予IFN-β则能逆转IRF7敲除带来的保护作用，加重癫痫发作。
6. IRF7核转位是TLE中IFN-β释放的关键步骤
免疫荧光和细胞组分分离蛋白质印迹实验发现，在TLE环境下，小胶质细胞中的IRF7发生磷酸化并显著向细胞核内转位。使用核输入抑制剂Importazole阻断IRF7核转位，可以显著抑制IFN-β的分泌，并减少共培养系统中神经元的异常放电。这表明IRF7的核转位是驱动IFN-β释放和下游神经炎症的关键环节。
7. IRF7通过I型干扰素反应介导RORB+神经元损伤
单细胞数据细胞互作分析显示，在TLE组织中，小胶质细胞主要与RORB+兴奋性神经元发生相互作用。RNA测序GSEA提示IRF7敲除可减少神经元凋亡和自噬。实验证实，TLE条件下神经元中RORB表达下降，而神经炎症和损伤标志物pSTING表达升高；IRF7敲除可部分恢复RORB水平并降低pSTING。机制上，研究首次发现RORB可作为转录因子直接结合并激活神经保护基因STIM1的启动子。然而在TLE环境下，由IRF7/IFN-β轴驱动的神经炎症会抑制RORB的表达，进而下调STIM1，破坏神经元稳态，导致其易损性增加和过度兴奋。
8. 靶向小胶质细胞IRF7调控网络可减轻TLE相关的海马硬化
海马硬化是癫痫发作的基础病理过程，常伴随认知记忆损害。行为学测试（新物体识别、开放场）显示，IRF7敲除的TLE小鼠认知记忆功能和探索行为得到显著改善，焦虑样行为减轻。磁共振成像(MRI)分析进一步表明，IRF7敲除显著减轻了海马萎缩，具有神经保护作用。
综上所述，本研究通过整合计算生物学与实验验证，系统描绘了IRFLE中神经炎症调控的新通路：TLE诱导小胶质细胞激活并向以IRF7驱动的促炎表型极化；活化的IRF7发生核转位，启动I型干扰素反应并释放IFN-β；IFN-β作用于易损的RORB+神经元，通过抑制RORB-STIM1这一神经保护轴，破坏神经元稳态，最终导致神经元过度兴奋、癫痫发作和海马硬化。相反，敲除IRF7可促进小胶质细胞向抗炎表型转化，增强神经元韧性，从而对抗癫痫表型和海马硬化进展。
在讨论部分，作者强调了本研究首次将GRN分析应用于癫痫研究，超越了传统的细胞组成和差异基因分析，从转录调控层面识别出IRF7这一核心驱动因子。研究不仅将IRF7介导的干扰素相关炎症与神经元RORB-STIM1信号通路联系起来，阐明了小胶质细胞-神经元互作的具体分子机制，还通过多层面实验验证了靶向IRF7在体内外均能有效改善癫痫表型和相关认知障碍。这项工作丰富了神经炎症在癫痫进展中的机制理解，并指出调控IRF7介导的I型干扰素反应是预防癫痫发作的一个有前景的治疗新靶点，为开发针对耐药性癫痫的免疫调节疗法提供了重要的理论依据和实验证据。
