《Geoderma》：Differential responses of prokaryotic and fungal communities in soil microenvironments to drying and wetting as affected by soil aggregate isolation method
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为了解决不同团聚体分离方法（干筛与湿筛）可能对土壤微生物群落分析造成的人为偏差问题，研究人员比较了两种方法对四种粒径团聚体中微生物群落的影响。研究表明，土壤预处理（干燥）是驱动微生物群落差异的主要因素，原核生物群落对所有处理均敏感，而真菌群落在较大团聚体中更稳定；此外，干燥提高了原核生物的平均rRNA基因拷贝数和基因组大小，而湿筛降低了微团聚体及粉粘粒中的碳氮含量。该研究为土壤微生物生态学研究中方法选择提供了重要依据。
土壤是地球生命的关键支持系统，它并非均质的实体，而是由大小不一的团聚体构成的复杂三维结构。这些团聚体，从肉眼可见的宏观颗粒到微观的微小集合体，为无数微生物提供了独特的栖息“微环境”。长久以来，科学家们相信不同大小的团聚体栖息着不同的微生物群落，这对于理解土壤碳循环、养分转化和生态系统功能至关重要。然而，一个长期存在的“方法学难题”阻碍了研究的清晰比较：即不同研究采用的团聚体分离方法——主要是干筛法和湿筛法——存在显著差异。这两种方法对土壤施加的物理和水分胁迫不同，它们是否会“过滤”或“扭曲”我们所见到的微生物世界图景？更重要的是，土壤在分离前的储存状态（田间湿润状态 vs. 干燥状态）会如何与分离方法相互作用，影响最终的微生物群落分析结果？这个问题一直悬而未决。
为了解开这个谜团，来自加州大学戴维斯分校的研究团队在《Geoderma》上发表了一项研究，系统探究了干筛与湿筛这两种常用方法，在土壤处于田间湿润或预干燥状态下，对四种不同粒径团聚体（大团聚体（>2000 μm）、小团聚体（250–2000 μm）、微团聚体（53–250 μm）以及粉粒与粘粒（<53 μm））中原核生物和真菌群落的影响。他们的研究不仅揭示了两种微生物类群对处理响应的显著差异，还深入探讨了相关的微生物功能性状和土壤碳氮动态，为未来土壤微生物生态学研究的方法选择提供了关键的实验证据和实用建议。
本研究主要采用了以下几种关键技术方法：首先，研究者从美国加州大学戴维斯分校Russell Ranch可持续农业研究站的长期田间试验地采集土壤样品，该试验涉及不同施肥处理（如粪肥堆肥和合成矿物肥料）。其次，他们系统实施了四种团聚体分离处理组合：对田间湿润土壤进行干筛（Field）、对田间湿润土壤进行湿筛（Field+Pulse）、对预干燥土壤进行干筛（Dry）以及对预干燥土壤进行湿筛（Dry+Pulse）。第三，利用高通量测序技术，针对原核生物群落扩增了16S rRNA基因的V4高变区，针对真菌群落扩增了内部转录间隔区（ITS），并进行生物信息学分析。第四，采用系统发育估计方法，基于16S rRNA基因序列数据预测了原核生物群落的两个重要功能性状：核糖体RNA基因（rrn）拷贝数和基因组大小。最后，运用多元统计方法（如PERMANOVA、PLS排序）分析了群落结构的差异，并测定了各团聚体组分中的总碳和总氮含量。
研究结果
4.2. 原核生物群落对筛分处理的一致性响应
原核生物群落的组成在所有样本中均受到筛分处理、团聚体大小和施肥处理的显著影响。通过PLS排序分析发现，群落结构因处理而明显分离，其中土壤湿度（干燥与否）是驱动变化的主要因素，而筛分方法本身的影响较小。原核生物群落还按团聚体大小聚类，大、小团聚体聚为一组，微团聚体与粉粘粒聚为另一组。在所有团聚体粒径中，筛分处理均显著改变了原核生物群落组成，且在微团聚体和粉粘粒组分中观察到的影响效应更大。在Alpha多样性方面，Field+Pulse处理（田间湿土湿筛）的原核生物丰富度（ESV数量）和香农指数通常高于其他处理。在群落组成上，干燥处理降低了亚硝化球菌属（Candidatus Nitrososphaera，一种氨氧化古菌）的相对丰度，而增加了芽孢杆菌属（Bacillus）、芽球菌属（Blastococcus）和诺卡氏菌属（Nocardioides）等类群的丰度。
4.3. 真菌群落对筛分处理的响应因团聚体大小而异
与结果相似，真菌群落组成也受筛分处理、团聚体大小和施肥处理的显著影响。然而，与结果形成鲜明对比的是，筛分处理对大团聚体和小团聚体中的真菌群落组成没有显著影响。相反，在微团聚体和粉粘粒组分中，筛分处理则显著改变了真菌群落结构。真菌群落的离散度也受处理影响，湿筛处理降低了群落的异质性。在Alpha多样性方面，Dry+Pulse处理（干土湿筛）的真菌丰富度和香农指数在所有样本以及小团聚体、微团聚体和粉粘粒中均低于其他处理，但在大团聚体中没有差异。真菌群落主要由担子菌门（Basidiomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）和子囊菌门（Ascomycota）主导。湿筛处理增加了腐生菌和共生菌的相对丰度，同时增加了植物病原菌的相对丰度。
4.4. 处理对原核生物性状和真菌功能类群的影响
筛分处理显著影响了从16S rRNA基因序列估算出的微生物功能性状。总体而言，Dry和Dry+Pulse处理的群落加权平均rrn拷贝数和基因组大小均高于Field和Field+Pulse处理。值得注意的是，在微团聚体和粉粘粒组分中，湿筛处理降低了这两个性状的平均值，但在大、小团聚体中没有观察到这种效应。具体而言，在微团聚体中，Dry+Pulse处理的平均rrn拷贝数低于Dry处理；在粉粘粒中，两种湿筛处理的平均rrn拷贝数和基因组大小均低于其对应的干筛处理。
在真菌功能类群方面，湿筛处理显著降低了被归类为腐生菌以及腐生菌或共生菌的真菌相对丰度，同时增加了病原菌的相对丰度。这具体体现在湿筛处理降低了未定义腐生菌和叶片腐生菌等功能类群的丰度，但增加了植物病原菌类群的丰度。
4.5. 处理对团聚体总碳和总氮的影响
湿筛处理降低了所有样本中的总碳浓度，但对总氮没有影响。当分析各团聚体粒径内的处理效应时，发现不同模式：在大团聚体和小团聚体中，筛分处理对总碳没有影响，但Dry+Pulse处理增加了这两个组分中的总氮。在微团聚体和粉粘粒中，湿筛处理导致总碳和总氮（在微团聚体中）或仅总碳（在粉粘粒中）显著降低。此外，施加堆肥的田块样品在各团聚体粒径和处理组中通常具有更高的总碳和总氮浓度。平均rrn拷贝数与团聚体总碳和总氮呈正相关，但基因组大小与此无关。
研究结论与讨论
本研究证实，土壤团聚体分离方法（干筛与湿筛）及其前置的土壤湿度条件对土壤微生物群落，特别是原核生物和真菌，产生了显著且差异化的影响。研究得出几个核心结论：首先，土壤在筛分前的湿度状态（干燥与否）是驱动微生物群落变化的最主要因素，其影响力甚至超过筛分方法本身。其次，原核生物和真菌对处理的响应模式不同：原核生物群落对所有处理（干燥和湿筛）均表现出敏感性，而真菌群落在较大的宏团聚体中表现出更强的抵抗力，其组成和Alpha多样性在微团聚体和粉粘粒中才受到显著影响。第三，干燥处理倾向于筛选出具有更高rrn拷贝数和更大基因组的原核生物类群，这可能与它们适应干燥胁迫和利用干燥过程中释放的养分的能力有关。第四，湿筛处理改变了真菌的营养策略，降低了腐生菌和共生菌的比例，同时增加了病原菌的比例，并降低了微团聚体及粉粘粒中的碳氮含量。
这些发现具有重要的方法论意义。研究表明，虽然干筛和湿筛都能揭示不同团聚体间的微生物群落差异，但湿筛过程，尤其是对预干燥土壤进行湿筛，会削弱不同粒径团聚体间微生物群落的差异，可能导致对原位微生物生态的代表性出现偏差。因此，为了最大限度地保留和反映土壤团聚体原位微生物群落的特征，研究人员建议在可能的情况下，优先考虑将土壤干燥至“最佳湿度”后进行干筛的方法。然而，研究也指出，最佳方法的选择可能因土壤质地、管理历史等因素而异。
总之，这项研究强调了在土壤微生物生态学研究中，样品预处理和分离方法的选择必须根据具体科学问题仔细考量，因为它们本质上代表了微生物群落所经历的不同水分饱和与扰动条件。该研究为在日益重要的团聚体尺度上探究土壤微生物生态提供了关键的方法学见解和实践指南。
