采用绿色超声辅助提取技术结合气相色谱-质谱（GC-MS）方法，用于鉴定生物基食品接触材料中故意添加和无意添加的各类物质

《Green Analytical Chemistry》：Green ultrasound-assisted extraction and GC-MS for the identification of intentionally and non-intentionally added substances in bio-based food contact materials

　　莫里齐奥·皮尔乔瓦尼（Maurizio Piergiovanni）| 马可·丰塔纳罗萨（Marco Fontanarosa）| 尼科洛·里博尼（Nicolo’ Riboni）| 安东内拉·卡瓦扎（Antonella Cavazza）| 莫妮卡·马塔罗齐（Monica Mattarozzi）| 费德里卡·比安基（Federica Bianchi）| 玛丽亚·卡雷里（Maria Careri）
意大利帕尔马大学（University of Parma）化学、生命科学与环境可持续性系（Department of Chemistry, Life Sciences and Environmental Sustainability），帕尔马，43124

**摘要**
随着对传统塑料的可持续替代品的追求，生物塑料作为食品接触材料（Food Contact Materials, FCMs）的应用正在迅速扩展，其中聚乳酸（Polylactic Acid, PLA）是最广泛使用的生物聚合物之一。生物塑料的复杂性使得有意添加和无意添加的物质（Intentionally Added Substances, IAS）及非有意添加的物质（Non-Intentionally Added Substances, NIAS）的提取与检测变得尤为困难，这需要开发高效且环保的分析方法。本研究采用了一种基于超声波辅助提取后结合气相色谱-质谱（GC-MS）的绿色分析方法，用于从商用生物基食品接触材料中非针对性地分析这些物质。这是首次将“分析质量设计”（Analytical Quality by Design, AQbD）原则应用于提取过程优化。通过筛选设计确定了关键的方法参数，包括溶剂类型、提取时间和超声处理时间，并对比了传统溶剂与绿色溶剂的效果。结果表明，环戊基甲基醚（Cyclopentyl methyl ether）具有最高的提取效率，同时还能缩短提取时间。该方法的操作范围为：提取时间8:30小时至10:50小时，超声处理时间为10–25分钟。作为概念验证，该优化程序被应用于生物塑料制品，成功检测到了属于不同化学类别的39种挥发性化合物。多变量数据分析表明该方法能够根据样品成分对其进行准确分类，证明了其在质量控制方面的适用性。最后，利用AGREE、BAGI和CHEMS-1指标评估了该方法的环保性和实用性，结果显示其符合绿色分析化学的原则。

**引言**
生物塑料作为一种可行的替代品，为化石基聚合物提供了可持续、环保的解决方案。聚乳酸（PLA）是一种由玉米和淀粉等可再生植物资源制成的脂肪族聚酯，是目前市场上最丰富的生物聚合物之一；预计其欧洲市场份额将从2023年的31.0%增长到2028年的43.6%[1]。PLA广泛应用于众多领域，尤其在食品包装领域，用于生产薄膜、杯子、容器以及各种刚性和柔性材料[2]（欧盟指令2019/904 [3]推动了这一趋势）。PLA还具有生物降解性、生物相容性、相对较低的成本和光学透明度等优势。然而，与传统石油基聚合物相比，PLA在耐热性和高温下的机械性能方面存在不足。为了解决这些问题，PLA常与其他可生化聚合物（如聚丁酸琥珀酸酯（PBS）、聚（丁酸琥珀酸酯-己二酸酯）（PBSA）和聚羟基链烷酸酯（PHA）混合使用，或添加功能性添加剂和活性成分以提升性能[4]。

尽管生物基材料本身无害，但其生产过程中可能含有潜在有害物质，这些物质有可能迁移到食品和饮料中[5]。因此，作为食品接触材料使用的生物塑料的安全性一直备受争议，尤其是其中可能包含的故意添加物质（IAS）和非故意添加物质（NIAS）[6–8]。IAS包括单体、起始物质、添加剂、聚合物生产助剂、增塑剂和溶剂等，在制造过程或产品最终使用中可能起到增强稳定性、改善机械性能或延长保质期的作用。NIAS如杂质、污染物以及合成过程中产生的反应或降解产物也可能存在于食品接触材料中，必须对其进行严格评估。进行全面的风险管理需对食品中的IAS和NIAS进行识别和定量，这涉及材料提取或迁移测试。此类测试通常遵循欧洲法规[9]进行。不过，目前尚无针对生物聚合物的统一立法或具体检测方案[10]。为应对新兴的食品安全问题，基于质谱（MS）的非靶向分析方法已成为重要工具[7]。虽然对生物塑料的全面表征需结合多种分析技术（主要是气相色谱[GC]和液相色谱[LC] [10]），但许多研究聚焦于挥发性/半挥发性物质的分析[8,11,12]。由于迁移到食品模拟物中的化合物浓度可能极低，因此提出了多种提取方案以提高IAS和NIAS的释放效率。为提升提取效率，提出了超声波辅助提取（UAE）、微波辅助提取（MAE）和加速溶剂提取（ASE）等新技术[13]，它们能有效增强能量交换和质量传递，显著缩短提取时间[13]。研究表明了多种溶剂（如甲醇[MeOH] [8,14]、乙醇[EtOH] [15]、己烷[Hex]、二氯甲烷[DCM] [16]、丙酮[AcO]和甲苯[Tol] [17]以及溶剂混合物[18,19]的提取能力。

近年来，绿色提取方法因环保特性而受到重视。根据绿色分析化学（Green Analytical Chemistry, GAC）[20]原则，人们致力于减少或消除有毒物质的使用、减少废物并保障操作人员安全，从而推广了离子液体[21]、深共晶溶剂[22]、环戊基甲基醚（CPME）[23]和生物基乙醇等绿色溶剂[24]。CPME因环境影响小、安全性高和提取效率高而成为传统溶剂（如Hex和DCM）的替代品[16]。二氧六环庚烷（Diox）也显示出类似CPME的性能[25]，被视为DCM和四氢呋喃的环保替代品。尽管离子液体存在环境毒性问题[26]，但它们仍被用于提取过程。较短的提取时间、更低的有机溶剂消耗量以及更高的提取效率为绿色样品制备提供了优势[13]。分析方法开发中应用“质量设计”（QbD）原则越来越受到关注，AQbD为提取和分离过程提供了系统化框架[27]，通过明确多参数（CMPs）对分析结果（CMAs）的影响并确定操作范围（MODR），实现分析目标[28]。 AQbD已应用于从环境样本中提取增塑剂[29]、食品中异构多酚的分离[30]以及活性食品包装材料的开发[31]。据我们所知，这是首次将AQbD用于食品接触材料分析中的提取程序开发。

本研究旨在开发一种高效、可靠的绿色分析方法，用于检测生物塑料作为食品接触材料时释放的化合物。为了表征商业塑料样品的聚合物组成，还使用了衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）和差示扫描量热法（DSC）。基于AQbD原则，优化了一种基于UAE的提取方案，用于GC-MS检测IAS和NIAS。比较了CPME、1,3-二氧六环庚烷（Diox）和乙醇（EtOH）等绿色溶剂与传统溶剂（如异辛烷[Iso]、甲苯[Tol]和乙酸乙酯[EtAc]）的提取效果。多变量数据分析（PCA和LDA）有助于识别不同生物塑料材料的特征化合物。使用Analytical GREEnness calculator（AGREE）[33]评估了该方法的环保性，并评估了所用绿色与传统溶剂的风险值[34]。最后，根据实际操作需求，利用Blue Applicability Grade Index（BAGI）[35]评估了该方法的适用性。

**实验部分**
2.1 **化学试剂及材料**
Tol（纯度99.8%）、EtOH（96%纯度）、CPME（99.9%纯度）、Diox（99.9%纯度）购自Carlo Erba Reagents（意大利米兰）；Isooct（99.5%纯度）购自Labscan analytical sciences（波兰格利维采）；EtAc（99.7%纯度）购自Sigma-Aldrich（意大利米兰）。十五烷（C15）、十六烷（C16）、十七烷（C17）、十八烷（C18）、十九烷（C19）、二十烷（C20）、二十一烷（C21）、二十二烷（C22）、二十三烷（C23）、二十四烷（C24）、二十五烷（C25）、二十六烷（C26）、二十七烷（C27）、二十八烷（C28）、二十九烷（C29）和三十烷（C30）（纯度均>99%）均购自Merck（意大利米兰）。二丁基对酞酸酯（99%纯度）、二异丁基对酞酸酯（99%纯度）、十六烷酸（纯度>99%）、十八烷酸（95%纯度）及聚四氟乙烯（PTFE）注射器滤芯（0.2 μm）也来自Merck。

为避免环境污染，实验使用玻璃或不锈钢设备。使用前，所有玻璃器皿浸泡于10%盐酸中12小时，然后用milliQ水冲洗、高温处理6小时，最后用甲醇冲洗。

2.2 **样品**
共采集了25件生物塑料家用制品，包括18件餐具、2个碗、2包吸管和1包咖啡搅拌棒，均来自当地市场（见表S1）。分析前，样品在液氮环境下用A11基本分析研磨机（IKA, Staufen, 德国）研磨成粉末，收集后储存在-80°C直至提取。通过混合500 μL的样品提取物制备混合样本，作为每次色谱分析的质控样品（QCs），每5次分析重复使用一次。

2.3 **材料表征**
使用Spectrum Two FTIR光谱仪（PerkinElmer, Shelton, CT, 美国）在4000–400 cm?1范围内收集样品的ATR-FTIR光谱。每次测量平均进行16次扫描，分辨率为2 cm?1。每个样品重复测量三次。

2.4 **超声波辅助提取的优化**
选择十六烷酸、十八烷酸、十八烷酸2-羟基-1-（羟甲基）乙酯、十八烷酸2-羟基-1-（羟甲基）乙酯和二（2-乙基己基）辛酸酯（DOS）的色谱响应作为关键方法属性（CMAs）[29]。通过评估两个定量因素（提取时间Ext. time和超声处理时间UAE time）及一个定性因素（溶剂类型Solv. type）的影响，应用筛选设计确定最佳条件[29]。提取时间范围为4–14小时，超声处理时间范围为15–45分钟。对比了传统溶剂和绿色溶剂的效果：传统溶剂组包括Tol、EtAc和Isoct；绿色溶剂组包括CPME、Diox和EtOH。样品与提取溶剂的比例设定为20:1（基于先前的研究[17,37]）。通过响应面方法（RSM）和中心复合设计（CCF）选择最佳提取条件，并通过蒙特卡洛模拟确定操作范围（MODR）[38]。实验条件为：提取时间7–11小时，超声处理时间5–25分钟。在实验中心进行五次重复实验以评估实验误差。为综合考虑所有CMAs的影响，将最小值设定为最大响应的70%。在风险分析中，定义了每百万个机会的缺陷数（DPMO）目标为100,000，相当于10%的错误概率[29]。数据使用MODDE 13软件（Sartorius Data Analytics AB，德国哥廷根）进行处理。随后将优化后的提取程序应用于所有研究的样品：在试管中称取0.2克样品，并加入4毫升CPME[17]。试管密封后用铝箔覆盖，并通过超声波浴（J.P. Selecta，西班牙巴塞罗那）在室温和100%功率下进行处理。提取完成后，将提取物离心，用0.2微米PTFE注射器过滤器过滤，然后进行GC-MS分析。通过混合等体积的每种提取物制备的QC样品，根据与CMAs相关的响应来评估保留时间（RT）精度和方法精度。RT精度和方法精度均从重复性（通过同一天内进行的5次独立重复测量来评估）和中间精度（通过连续三天内进行的相同数量的独立重复测量来评估）方面进行评价，计算相对标准偏差（RSD%）。通过验证数据的同方差性和进行方差分析（ANOVA）以95%的置信水平来估计中间精度。最后，通过比较单个样品提取物的注释与QC样品的注释来验证化合物注释的选择性。

2.5. GC-MS分析
GC-MS的操作条件详细信息见补充材料。

2.6. 数据分析
挥发性化合物的注释是通过将实验质谱与Wiley 275和NIST17（国家标准与技术研究所）数据库中最佳的匹配光谱来进行的。
保留指数（RIs）是使用一系列从C15到C30的n-烷烃作为参考化合物来确定的，根据以下公式：
RI = (100z + 100(RTi ? RTz)) / (RTz + 1 ? RTz)
其中：
• RI是未知化合物的保留指数
• RTi是未知化合物的保留时间
• RTz和RTz+1分别是紧接在未知化合物之前和之后的n-烷烃的保留时间
• z对应于紧接在未知化合物之前的n-烷烃中的碳原子数
计算出的RIs与专有数据库[39]中存储的或文献[40]中可用的RIs进行了比较。为了确认目的，注射了1-十二烷醇、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、十六烷酸、二丁基邻苯二甲酸酯、双甲氧基乙基邻苯二甲酸酯、二十一烷、甲基十八酸酯、十八烷酸和芥子酰胺的纯标准品。

2.7. 绿色评估
使用AGREE指标方法[33]和计算研究中使用的绿色和传统溶剂的危险值来估计对GAC原则的遵守情况。参考值使用相应的安全数据表上的数据[34,41]。最后，应用BAGI方法将分析和实际性能标准与环境标准相结合[35]。

结果与讨论
材料表征
ATR-FTIR光谱（图S1）和DSC（图S2）被初步用于生物基材料的表征。ATR-FTIR光谱确认了所研究的样品基于不同的生物塑料材料，大多数光谱与PLA一致。羰基酯（C=O）伸缩带被用作快速识别主要成分的最显著特征。25个样品中有18个被鉴定为PLA（表S1），根据以下典型带：1748 cm-1的C=O伸缩（结晶相）对比1758 cm-1（非结晶相）；3000-2940 cm-1（2997和2939 cm-1的不对称和对称CH3伸缩），1453 cm-1（不对称 bending CH3），1383 cm-1（对称 bending CH3），1265-1047 cm-1（C–O–C伸缩），870 cm-1（O–CH–CH3吸收）和757 cm-1（α-CH3摆动）。
DSC分析也被用来支持ATR-FTIR获得的结果，并评估PLA样品是否符合其标签上标明的规格（是否结晶）。结果与声明的信息非常吻合（表S1）。

3.2. 筛选设计
应用初步的筛选设计来优化从FCMs中提取可提取和可浸出化合物的条件。选择CMAs是基于它们的不同保留时间，范围从10.96到21.73分钟，大约间隔3-5分钟，从而覆盖了大部分色谱窗口，并代表了FCM可提取物的物理和化学多样性。考虑到可能从家用物品中迁移出来的各种潜在污染物以及不同溶剂的提取效率，研究的初始阶段旨在确定最重要的提取参数，即溶剂类型、提取时间和超声波处理时间。根据最近的文献，选择了20的样品重量/提取体积比，这些文献报告称增加提取溶剂体积不会导致分析性能的显著差异。此外，初步评估证明了在测试溶剂体积的微小调整时色谱响应没有显著变化。最后，值得一提的是，由于本研究使用的是已建立程序的简化版本，所提出的方案与GAC的原则很好地吻合。对传统和绿色溶剂进行了比较评估，以评估它们的提取能力。图1（a,c,e,g,i,k,m,o,q,s）显示了模型系数的图形分析，其中每个条形代表两个定义水平之间变化的具体效应的大小。例如，b1/2-1显示了第一个关键方法参数（即溶剂类型）的水平从低（1）变为中等（2）时的效应大小。

3.3. 超声波辅助提取IAS和NIAS的优化
应用CCR方法，所有计算的模型均具有统计显著性（p < 0.05）。决定系数R2的范围从0.84到0.92，而预测变异系数Q2的范围在0.65-0.72之间。所有模型都没有出现拟合不足的情况。这些发现突出了所有模型的拟合优度和良好的预测能力。系数图显示在图S4中，每种CMAs的响应曲线图显示在图S5中。
提取时间（Ext. time）对所有研究的化合物的响应都有积极影响，而超声波处理时间（UAE time）对壬酸、十六酸2-羟基-1-(羟甲基)乙酯和十八酸2-羟基-1-(羟甲基)乙酯有显著积极影响。没有观察到显著的交互作用。对于提取时间（Ext. time），所有化合物都没有显著的二次效应；最后，30分钟的超声波处理时间显著提高了十八酸的提取效率。基于这些发现，选择了以下绿色溶剂的条件：CPME作为提取溶剂，提取时间为9小时，超声波处理时间为15分钟。
在传统溶剂中，Tol对所有分析物提供了最高的响应，除了十六酸2-羟基-1-(羟甲基)乙酯。对于这种化合物，Tol和Iso之间没有观察到显著差异。对于大多数化合物，提取时间不是显著因素，但十六酸及其甲基酯的情况除外，14小时通常提供了最佳结果。关于超声波处理时间（UAE time），除了十六酸2-羟基-1-(羟甲基)乙酯外，任何CMAs都没有观察到显著效应，对于这种化合物，30分钟的超声波处理时间提高了提取效率。考虑到15分钟的超声波处理时间足以有效提取大多数分析物，因此选择这个时间作为同时提取可提取和可浸出化合物的最佳折中点。总之，传统溶剂的最佳条件是Tol作为溶剂，提取时间为14小时，超声波处理时间为15分钟。在这些条件下，当使用CPME作为提取溶剂时，与Tol相比，提取化合物的峰数或GC响应没有显著差异（图S3），表明提取性能相当。
考虑到需要开发一种更环保的方法，可能具有更短的提取时间，CPME被选为最合适的溶剂。因此，进一步优化的实验条件设置为：提取时间：7-11小时，超声波处理时间：5-25分钟。色谱分离使用5%苯基/95%甲基聚硅氧烷GC柱进行，该柱子因其广泛的适用性而被选中。
在RT重复性和中间RT精度方面观察到了出色的结果，RSD始终低于0.5%。方法精度方面也取得了非常好的结果，RSD始终低于8%。ANOVA在3天内获得的平均响应之间没有显示出显著差异（p>0.05）。考虑到进行了独立重复测量，并且生物聚合物中存在的挥发性混合物非常复杂，所取得的结果证明了所开发程序的可靠性。最后，比较单个样品提取物的注释与QC样品的注释时没有发现问题，从而证明了方法的选择性。

3.3. 响应面方法优化超声波辅助提取IAS和NIAS
应用CCF后，所有计算模型都具有统计显著性（p < 0.05）。决定系数R2的范围从0.84到0.92，而预测变异系数Q2的范围在0.65-0.72之间。没有一个模型出现拟合不足的情况。这些发现突出了所有模型的拟合优度和良好的预测能力。系数图显示在图S4中，每种CMAs的响应曲线图显示在图S5中。
提取时间（Ext. time）对所有研究的化合物的响应都有积极影响，而超声波处理时间（UAE time）对辛酸、十六酸2-羟基-1-(羟甲基)乙酯和十八酸2-羟基-1-(羟甲基)乙酯有显著积极影响。没有观察到显著的交互作用。对于提取时间（Ext. time），所有化合物都计算出了负二次效应；最后，辛酸、十六酸2-羟基-1-(羟甲基)乙酯和十八酸2-羟基-1-(羟甲基)乙酯对超声波处理时间（UAE time）表现出负二次效应。每种CMAs的等高线图显示在图2中，其中对应于响应最大化的区域用红色标出。总体而言，当提取时间和超声波处理时间都设置在中间水平时，获得了最佳结果。这些发现进一步得到了图S6中所示的最佳点图的支持，该图通过叠加各个等高线图阐明了同时满足所有响应标准的区域。在所有研究中，除了Pitirollo等人[15]的研究外，仅使用了传统溶剂，并且使用量较大。总体而言，UAE是一种简单且成本效益高的提取技术，可以减少溶剂消耗和样品准备时间。在我们的研究中，使用较短的UAE时间间隔使得能够严格控制提取温度，这是一个关键因素，因为长时间的超声波处理可能会导致温度升高，从而影响提取效果和化合物的稳定性。所提出的UAE-GC–MS方法相较于基于GC–HRMS的方法还具有额外的优势。GC–MS能够提供足够的灵敏度和选择性，适用于常规分析，并且相比GC–HRMS，其运营和维护成本更低，可用性更高，使用也更简便。尽管GC–HRMS具有更高的分辨力和更精确的质量检测能力，但它需要更多的专业知识和资源，包括更高的能量消耗，这导致其在BAGI和AGREE指标上的得分较低。相比之下，GC–MS不需要高度训练的人员，并且可以利用广泛商用的光谱数据库，减少了对自制库的依赖。总体来说，所提出的方法代表了一种强大且实用的替代方案，适用于高通量和常规分析应用，无需使用高度专业化的仪器。

图3. 概率图作为UAE时间和提取时间的函数。MODR包含在10%等概率线内；十字表示稳健点，圆圈表示最佳设定点。

表1. 本研究使用的操作条件与以往研究中用于测定PLA基样品中IAS和NIAS的操作条件进行比较

| 溶剂 | 样品量（g） | 体积（mL） | 提取时间（h） | 提取技术 | 分析平台 |
|-----------------|---------|--------|---------|----------|-----------|
| MeOH | 320 | 1 | UAE+预浓缩 | UPLC-HRMS [8] |
| 丙腈 | 0.85 | 24 | 固液 | GC-HRMS [12] |
| MeOH | 0.21 | 10 | 24 | TD-GC-MS/MS [14] |
| 乙醇 | 320 | 1 | UAE+预浓缩 | GC-MS, HPLC-MS [15] |
| MeOH, AcO, Tol | 0.53 | 30 | UAE+预浓缩 | UHPLC-(HESI)HRMS [17] |
| 辛烷/丙酮 | 21 | 24 | 固液+预浓缩 | UHPLC-(HESI)HRMS [18] |
| DCM, 乙醇 | 0.25 | 12 | 1:15 | 溶解UAE+沉淀 | UPLC-MS [19] |
| DCM, 乙醇 | 0.25 | 12 | 2:30 | 溶解+UAE/重新沉淀 | GC-MS, GC-O-MS [44] |
| MeOH | 15 | 24 | 固液+预浓缩 | GC-MS [45] |
| CPME | 0.24 | 0.9 | 09:40 | 固液+UAE | GC-MST |

3.4. 挥发性化合物的鉴定与多变量数据分析
在优化条件下，对FCMs中的可提取和可渗出化合物进行了提取。典型的UAE-GC-MS色谱图见图S7。总共在每个家庭类别的至少两个样品中检测到属于不同化学类别的39种可通过GC分析的物质（表S3）。当质谱和保留指数匹配时，化合物被认为是被正确鉴定的，允许与在线数据库报告的值相比有最多15个RI单位的偏差，考虑到由于不同色谱柱和操作条件可能导致的差异。为了确认鉴定结果，注入了纯标准品，从而增加了鉴定的信心。图S8展示了一些光谱比较的例子。需要注意的是，由于参考标准品有限，许多IAS和大多数NIAS在光谱库中不存在：因此，一些化合物仍然无法鉴定或只能归类为一般的化学类别。在鉴定的化合物中，邻苯二甲酸酯是一类众所周知且普遍存在的增塑剂[46]。在我们的研究中，检测到了低强度信号，对应于二异丁基邻苯二甲酸酯、二丁基邻苯二甲酸酯和双羟基乙基邻苯二甲酸酯。DOS是另一种属于十酸酯类的增塑剂，常用于塑料材料的制造[47]。还观察到了1,6-二氧杂十二环十二烷-7,12-二酮，它是丁二酸的环状低聚物。Coralli等人[47]之前已将其检测为PBAT的热解产物，并且在可降解塑料袋和用于层压生物塑料的粘合剂中作为NIAS[48]。三丁基(Z)-丙烯-1-烯-1,2,3-三羧酸酯是一种公认的杂质，来源于乙酰三丁基柠檬酸酯的水解，后者是一种绿色且更安全的邻苯二甲酸酯替代品，常用于生物基产品的生产[49]。由于柠檬酸酯与极性聚合物具有良好的相容性，它们被广泛评价为PLA基生物塑料中的环保增塑剂[50]。磷酸三苯酯（即三苯基亚磷酸酯）不是欧盟法规10/2011中批准用于食品接触材料的添加剂[9]，然而欧洲食品安全局（EFSA）已确认含有α-羟基-ω-羟基聚[氧(甲基-1,2-乙二基)C10–16烷基酯的磷酸三苯酯聚合物可以用作FCMs中生产食品接触聚烯烃的添加剂[51]。此外，据报道三苯基亚磷酸酯还故意用作聚酯和基于聚酯的复合材料中的链延长剂，以增加聚合物的分子量[52]。这些发现表明，其在生物基产品中的存在可能是由于多种因素造成的，包括在生物基产品的配方中使用了聚烯烃、在回收或废物流过程中发生交叉污染，或者可能是由于未经授权添加到用于食品接触应用的生物塑料配方中。至于磷酸三苯酯（三苯基亚磷酸酯），它是许多聚合物（包括PLA/聚碳酸酯复合材料）中常用的阻燃剂[53]，但它也可以作为增塑剂使用，对PLA的结晶有积极作用[50]。7,9-二叔丁基-1-氧杂螺(4.5)十二-6,9-二烯-2,8-二酮是Irganox型抗氧化剂的已知降解产物[54]，而十六酸、十八酸及其相应的甲酯和芥酸酰胺通常被添加到塑料配方中作为润滑剂或滑爽剂[12,55]。

还检测到了多种烷烃。它们的存在可以解释为这些化合物是植物的天然成分[56]，尽管它们也可能来源于聚烯烃。这些发现表明，它们的存在可能是由于在回收过程中的交叉污染，特别是在混合塑料废物流的情况下[55]。另一个可能的解释是在PLA制造过程中有意添加了少量的聚丙烯或聚乙烯，以增强其机械性能。作为概念验证，首先进行了探索性PCA分析，以评估样品聚类并确定样品之间的关系。前四个主成分（PCs）解释了66.8%的方差，但除了样品P10完全位于正PC1值之外，没有观察到显著的样品分组（图S9a），这是由于其含有大量的脂肪族和芳香烃以及甲基棕榈酸酯（图S9b）。将其从数据集中移除后获得了更好的结果，因为在PC1与PC2（总方差的37.1%）以及PC1与PC4空间（总方差的34.2%）中观察到了部分样品聚类（图S10）。同样，应用了LDA来评估哪些挥发性化合物可以根据主要塑料成分（PLA、cPLA和noPLA）对样品进行分类。如图4a所示，观察到了三个不同的组，这些组在灵敏度、特异性和精确度方面都有良好的表现（表S4）[57]。区分这些组的最显著变量是那些标准化判别系数最高的变量（图4b）。其中，乙酰三丁基柠檬酸酯、芥酸酰胺、硬脂酸甲酯、7,9-二叔丁基-1-氧杂螺(4.5)十二-6,9-二烯-2,8-二酮、三苯基亚磷酸酯和三苯基亚磷酸酯在CV1中显示出负值，从而特征化了cPLA的谱型。根据CV2，观察到无定形PLA和noPLA基产品之间的区别，十六烯酸和十六酸2-羟基-1-(羟基甲基)乙酯在noPLA样品中的含量较高。如前所述，由于样本量较小，这些发现应被视为初步调查。未来将该方法应用于更大规模的生物塑料产品队列的研究应能得出更为稳健和普遍的结论。

图4. LDA分析：a) 分数图；b) 典型变量1和2的标准化加载图

3.5. 通过绿色指标评估UAE-GC-MS方法
与GAC框架的对齐对于开发高效且环境可持续的新分析方案至关重要。首先使用AGREE工具[33]通过将CPME和Tol的结果进行比较来评估所开发的UAE-GC-MS方法的绿色性。CPME的总分为0.59，Tol的总分为0.48（图5a和图5b）。考虑到程序的性能通过分配给每个段的颜色来表示，每个段都标有相应评估标准的编号，两种溶剂在所需样品量少（0.2克）、样品准备步骤少（3步）、过程自动化程度高、无需衍生化以及在单次运行中测定多种分析物（39种）方面都表现良好。主要的批评点与设备的离线性质以及使用GC–MS相关的相对高能耗有关。另一个缺点是使用了CPME，尽管它被认为是一种环保的溶剂，但并非基于生物的。因此，AGREE工具的原则n.10对CPME和Tol都标记为负面（红色）。然而，用CPME替换Tol对溶剂毒性和操作员安全产生了积极影响。

此外，还应用了CHEMS-1模型来补充评估用CPME替代Tol对环境和健康的影响。CHEMS-1基于多个标准评估溶剂的影响，包括对动物和人类的毒性、生物积累潜力、生物降解性和环境持久性，提供了关于生态和操作员安全性的定量视角[34]。使用这种方法，CPME和Tol的tHV值分别为24.1和48.3。特别是，Tol由于具有神经毒性以及对肾脏、肝脏和呼吸系统的不良影响，与其相关的慢性非癌症毒性危险值较高。此外，Tol对水生生物的急性 and 慢性毒性更大：CPME和Tol的taHV值分别为31.8和65.8，表明CPME的整体危险性明显低于Tol。最后，应用了BAGI工具来评估所开发分析程序的实际适用性[35]。如图5c所示，得分为70，表明所提出的UAE-GC-MS方法符合GAC的原则，同时保持了良好的操作可行性。最低得分（2.5）与分析类型（定性）相关，如示意图中的白色部分所示，而高分（得分10）对应于以下属性（示意图中的深蓝色部分）：多元素分析（超过15种化合物）；常用试剂；无需预浓缩和所需样品量。这一结果强调该方法不仅环境可持续，而且可以在常规实验室环境中容易实施，无需先进设备或复杂仪器。综合良好的BAGI得分和积极的AGREE评估结果，证实了该方法的适用性和可持续性，增强了其在分析实践中的广泛采用潜力。

结论
开发了一种绿色、高效且可靠的UAE-GC-MS方法，用于分析FCMs中使用的生物塑料的可提取和可渗出物质。在此领域中，首次应用了QbD方法来优化提取条件。通过将筛选设计、响应面方法和蒙特卡洛模拟整合到一个综合实验方法中，建立了一种使用CPME作为比传统溶剂更环保的替代品的稳健且高效的协议。CPME能够在较短的接触时间内有效从生物塑料中提取IAS和NIAS，从而减少了分析时间，同时保持了高提取效率。MODR的鉴定确保了分析的可靠性和最佳提取性能。作为概念验证，该方法被应用于分析由PLA、cPLA和其他生物塑料材料制成的商业产品。鉴定出的挥发性化合物包括可作为增塑剂、润滑剂或其他添加剂的各类化合物。还鉴定出了抗氧化剂的降解产物。多变量数据分析允许根据样品的组成进行正确分类，证明了该方法在质量控制方面的适用性。该方法与GAC原则的高度一致性也得到了证实，在分析性能和环境可持续性方面均取得了积极结果。结合使用AGREE、BAGI和CHEMS-1工具，全面评估了该方法的绿色性、适用性和安全性，证实了用更环保的替代品替代传统溶剂的益处。总体而言，该研究强调了所提出的方法论作为可靠且环保的替代方案的潜力，适用于实验室的常规操作。

**CRediT作者贡献声明**
- **概念化**：A. Cavazza, F. Bianchi, M. Careri
- **数据管理**：M. Piergiovanni, N. Riboni, A. Cavazza, M. Mattarozzi, F. Bianchi
- **形式分析**：M. Piergiovanni, M. Fontanarosa, N. Riboni
- **方法论**：N. Riboni, A. Cavazza, M. Mattarozzi, F. Bianchi
- **指导**：F. Bianchi, M. Careri
- **资金支持**：M. Careri
- **可视化**：M. Piergiovanni, N. Riboni, F. Bianchi
- **初稿撰写**：M. Fontanarosa, N. Riboni, A. Cavazza, F. Bianchi
- **撰写-审稿与编辑**：M. Piergiovanni, N. Riboni, A. Cavazza, M. Mattarozzi, F. Bianchi, M. Careri

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**数据可用性**
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**CRediT作者贡献声明**
- **Maurizio Piergiovanni**：撰写-审稿与编辑、可视化、形式分析、数据管理、概念化
- **Marco Fontanarosa**：撰写-初稿、形式分析
- **Nicolo’ Riboni**：撰写-审稿与编辑、撰写-初稿、可视化、方法论、形式分析、数据管理
- **Antonella Cavazza**：撰写-审稿与编辑、撰写-初稿、方法论、数据管理、概念化
- **Monica Mattarozzi**：撰写-审稿与编辑、方法论、数据管理
- **Federica Bianchi**：撰写-审稿与编辑、撰写-初稿、可视化、指导、方法论、数据管理、概念化
- **Maria Careri**：撰写-审稿与编辑、指导、资金争取、概念化