通过反向疫苗学方法，设计一种针对鹦鹉热衣原体（Chlamydia psittaci）质粒蛋白的多表位疫苗

《International Journal of Biological Macromolecules》：Design a multi-epitope vaccine targeting Chlamydia psittaci plasmid proteins through reverse vaccinology

基于反向疫苗学构建的沙眼衣原体多表位亚单位疫苗通过计算筛选和动物实验验证，显示其具有高免疫原性和Th1型细胞免疫应答，能有效诱导特异性IgG抗体及细胞因子产生，但需进一步临床研究。

　　

徐凌兰|梁明星|陈志希|朱宇涵|吴俊波|袁华敏|彭斌|李然辉|卢杰

中国南方医科大学衡阳医学院附属湖南职业病防治研究所临床实验室，湖南长沙410021

摘要

鹦鹉热衣原体（C. psittaci，简称Cps）是一种人畜共患疾病，可引起发热和呼吸系统问题，常被误诊为普通感冒，但往往会发展成肺炎。目前尚无针对C. psittaci的批准疫苗，以往尝试开发安全有效的预防措施都未能成功。先前的研究表明，质粒蛋白在该病的发病机制中起重要作用，但其毒性较高。本研究采用基于反向疫苗学的免疫信息学方法，以提高这些质粒蛋白的免疫原性并降低其毒性。最终设计的多表位亚单位疫苗包含了八个B细胞表位、五个细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位和两个辅助T淋巴细胞（HTL）表位以及连接子。该疫苗已提交进行结构预测和性能评估。通过分子对接和动态模拟等先进计算技术，研究了疫苗与佐剂之间的相互作用。所开发的多表位亚单位疫苗在抗原性和免疫效果方面表现出良好潜力。小鼠模型实验表明，接种疫苗后产生了高水平的特异性血清IgG抗体（包括IgG1、IgG2a和IgG3），同时引发了以IFN-γ和TNF-α为主的Th1型细胞因子反应。尽管该疫苗在小鼠模型中表现出较强的免疫原性，但仍需在更大规模的动物研究和临床试验中进一步验证其安全性和有效性。

引言

衣原体是一种革兰氏阴性、专性细胞内细菌，具有双相生命周期。这一周期包括代谢不活跃的基本体（EB）和代谢活跃的网状体（RB）[1]。作为Chlymediaceae家族的一员，C. psittaci是一种依赖宿主细胞获取能量和进行复制的寄生细菌。当其感染性形式（EB）被吸入并侵入呼吸道细胞后，会转化为复制形式（RB），利用宿主资源大量繁殖。通过逃避免疫反应并在细胞内形成包涵体，最终导致局部组织损伤和全身性感染[2]。除了形成包涵体这一核心策略外，C. psittaci还通过分泌效应蛋白抑制凋亡和干扰抗原呈递等机制实现逃避[3][4][5][6]。

C. psittaci可通过吸入受污染的气溶胶或直接接触感染动物传播。进入呼吸道后，首先攻击上皮细胞，随后进入肝脏和脾脏[7]。细菌在宿主细胞内迅速繁殖，侵入肺组织，引发明显的炎症反应，可能导致出血和肺炎。在严重情况下，感染可能发展为菌血症，使细菌扩散至多个器官，损害心脏、肝脏和胃肠道等重要系统[8]。C. psittaci可感染多种鸟类和哺乳动物，包括人类，是社区获得性肺炎的常见病因。该病的症状多样，从无症状携带到严重的非典型肺炎和全身并发症都有可能[9]。35至55岁人群中鹦鹉热的发病率最高。若不及时治疗，死亡率可高达30%[11]。

由于鹦鹉热的临床表现多样且公众对其认识不足，临床医生在诊断时容易混淆。四环素类药物（如多西环素）曾是治疗人类鹦鹉热的首选药物，因为它们对衣原体有效[12]。喹诺酮类也曾用于治疗衣原体感染，但有文献记录显示其治疗效果不佳[10]。由于水平基因转移和点突变，一些抗生素（如四环素和喹诺酮类）已出现耐药性[13]。在猪中，某些C. suis菌株已对四环素产生耐药性，这表明衣原体属细菌在体内条件下也可能对抗生素产生耐药性[14]。为有效对抗C. psittaci感染，疫苗接种成为一种有前景的策略[15][16][17]。

与传统疫苗开发方法相比，反向疫苗学（RV）代表了范式的转变。传统疫苗生产过程涉及培养、分离和纯化目标微生物，虽然历史意义重大，但越来越被认为资源密集、劳动强度高且效率低下[18][19][20]。相反，反向疫苗学直接从病原体的基因组或蛋白质组序列出发，利用生物信息学工具高效、低成本地筛选潜在抗原候选物[21][22]。这种方法消除了对病原体培养的依赖，使得难以培养的病原体也能开发出疫苗，并能系统识别潜在靶点（包括低表达或保守的靶点）。然而，这种计算驱动方法的核心在于需要通过严格的体外和体内实验验证其预测结果，以确认其免疫原性和保护效果。因此，本研究通过反向疫苗学平台识别的抗原候选物为后续实验验证提供了明确且具有高度潜力的目标。

通过对C. psittaci感染机制的持续研究，越来越多的蛋白质被确认在疾病过程中起关键作用。衣原体质粒是重要的毒力因子，携带编码细菌感染和免疫反应所需蛋白质的基因[23]。先前的研究指出，CPSIT_p6、CPSIT_p7和CPSIT_p8等质粒蛋白对抵抗Cps感染至关重要。然而，这些质粒蛋白的毒性使其难以直接用于疫苗开发[24]。为此，研究者开发了反向疫苗学方法，利用质粒蛋白设计疫苗的同时降低毒力风险，同时增强疫苗的免疫原性，提高免疫系统识别和对抗衣原体感染的能力。从完全测序的C. psittaci 6 BCE菌株中选出了七种质粒蛋白，经过B细胞和T细胞表位筛选后，将构建具有增强免疫效果的多表位疫苗（MEV）。

材料与方法

图1和表1分别展示了所有步骤及相关网站。

质粒蛋白的评估

虽然Cps质粒上的大多数蛋白质都具有毒力因子，但并非所有蛋白质都适合用于疫苗开发。因此，在进行表位预测之前，必须对蛋白质进行评估。初步分析Vaxijen服务器的结果后，四种抗原性评分低于0.4的蛋白质被排除。剩余的三种蛋白质G5O_p0003、G5O_p0004和G5O_p0005继续接受评估。

Cps的现状

C. psittaci是一种人畜共患的衣原体，是导致人类和多种动物持续感染的重要病原体[58]。从长远来看，探索针对Cps的替代治疗策略（如疫苗开发）可能是一种更经济有效的管理方法。疫苗在刺激免疫系统对抗病原体引起的疾病方面起着关键作用。

结论

C. psittaci是一种普遍存在的专性细胞内人畜共患病原体，能够感染人类、哺乳动物和鸟类。开发疫苗对于预防这种感染至关重要。本研究利用质粒蛋白开发了一种创新的治疗策略，该疫苗具有合适的结构、理化和免疫学特性。

缩写说明

SVM
支持向量机
MHC
主要组织相容性复合体
HLA
人类白细胞抗原
PDB蛋白质数据库
RV
反向疫苗学
TLR
Toll样受体
NCBI
美国国家生物技术信息中心
PI
理论等电点
CTL细胞毒性T淋巴细胞
HTL辅助T淋巴细胞
IFN干扰素
GRAVY平均疏水性
MD分子动力学
MM-PBSA
分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积
CAI密码子适应指数
RMSD均方根偏差
RMSF均方根波动

CRediT作者贡献声明

徐凌兰：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证。梁明星：监督，研究，数据分析。陈志希：数据管理，概念构思。朱宇涵：方法学研究。吴俊波：数据分析，资金筹集。袁华敏：数据分析。彭斌：研究，资金筹集。李然辉：撰写 – 审稿与编辑，资金筹集。卢杰：可视化，方法学研究。

伦理审批与参与同意

不适用。

资金支持

本项目得到了国家自然科学基金（编号：31800162）、湖南省自然科学基金（编号：2025JJ81057、2024JJ9585、2023JJ30523、2023JJ50145）、湖南省教育厅重点项目（编号：24A0297）、湖南省卫生健康委员会一般科研项目（编号：W20243156）以及怀化市青年人才支持计划的资助。

利益冲突声明

作者未报告任何潜在的利益冲突。

致谢

无。