揭示过氧化物还原酶抑制剂与Dinaciclib诱导的溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）中类似铁死亡（ferroptosis）的细胞死亡之间的机制联系

《International Journal of Biological Macromolecules》：Unveiling the mechanistic link between peroxiredoxin inhibition and ferroptosis-like cell death induced by Dinaciclib in Entamoeba histolytica

铁死亡机制在利什曼原虫中研究，Dinaciclib通过抑制EhPrx引发氧化应激和脂质过氧化介导的细胞死亡，揭示新型抗阿米巴药物靶点。

　　

李文杰|周瑞雪|戴东|张宏泽|冯萌|程勋佳

复旦大学基础医学科学院医学微生物学与寄生虫学系，上海，20032，中国

摘要

溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）缺乏典型的基于谷胱甘肽的抗氧化系统，主要依赖硫氧还蛋白（thioredoxin）途径来维持氧化还原平衡，这使得过氧化还原蛋白（EhPrx）成为其关键的脆弱点及潜在的治疗靶点。通过基于结构的筛选，发现Dinaciclib是一种新型的EhPrx直接抑制剂。Dinaciclib对EhPrx的药理作用会触发一种类似铁死亡（ferroptosis）的细胞死亡途径，其特征是氧化应激以及细胞内铁和脂质过氧化物的显著积累。相比之下，已知的铁死亡诱导剂RSL3并未引发脂质过氧化，反而上调了EhPrx的表达，这表明该物质可能具有对抗间接氧化应激的适应性防御机制。Dinaciclib处理后的转录组分析显示，与铁死亡相关的基因（包括参与铁、脂质和半胱氨酸代谢的基因）出现了广泛的失调。总体而言，我们的研究结果表明，靶向EhPrx能够破坏寄生虫的主要氧化还原防御机制，从而导致由铁驱动的细胞死亡。因此，本研究将EhPrx确定为一个可利用的靶点，并提出了一种在溶组织内阿米巴中触发类似铁死亡的过程。

引言

阿米巴病是由溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica）引起的一种寄生虫感染，目前仍是全球重要的公共卫生问题[1]。它是全球第三大常见寄生虫病，每年导致约5000万例阿米巴性痢疾和肝脓肿病例，以及大约55,000人死亡，主要发生在卫生条件较差的地区[2]、[3]。溶组织内阿米巴的生存和致病性关键在于其抵御氧化应激的能力。然而，这种寄生虫的抗氧化防御机制并不传统。

与大多数真核生物不同，溶组织内阿米巴缺乏典型的抗氧化系统（如谷胱甘肽及其依赖的酶[4]）。相反，它主要依赖硫氧还蛋白系统——包括NADPH、硫氧还蛋白还原酶（TrxR）和硫氧还蛋白（Trx）来维持氧化还原平衡[5]、[6]、[7]、[8]。在该系统中，过氧化还原蛋白（Prxs）是抵御过氧化物的主要防线[9]、[10]。作为兼性厌氧菌，溶组织内阿米巴对氧气非常敏感，氧化应激会显著上调Prx的表达，这突显了其在生存中的关键作用[11]。重要的是，EhPrx的活性与其毒力相关，其表达水平越高，寄生虫的耐受性和致病性越强[12]、[13]、[14]、[15]。通过基因沉默EhPrx可以降低滋养体的存活率并减轻体内的疾病症状，这明确表明EhPrx是一个重要的毒力因子[16]。因此，EhPrx是一个有前景但尚未充分研究的阿米巴病治疗靶点[10]。为了利用这一脆弱性，我们采用了基于结构的发现策略。由于没有EhPrx的实验结构，我们生成了一个三维同源模型，并用它来筛选小分子库中的潜在抑制剂。在这些候选物中，Dinaciclib被鉴定为一种新型的EhPrx直接抑制剂。Dinaciclib处理可诱导滋养体出现类似铁死亡的细胞死亡现象，表现为氧化应激以及脂质过氧化物和细胞内亚铁的积累。而经典的铁死亡诱导剂RSL3则未能引发脂质过氧化，反而上调了EhPrx的表达。这种差异效应得到了RSL3与EhPrx之间较低结合亲和力的支持，表明直接抑制EhPrx是导致观察到的细胞死亡的关键机制。本研究证明，Dinaciclib对EhPrx的药理作用会破坏氧化还原平衡，并符合类似铁死亡的途径。我们的发现表明Dinaciclib是一种潜在的抗阿米巴候选药物，并强调了EhPrx在通过对抗氧化应激来维持寄生虫生存中的关键作用。

部分内容摘要

同源建模与虚拟筛选

我们使用同源建模方法预测了溶组织内阿米巴 Prx的三维结构。以EhPrx的氨基酸序列（GenBank登录号：GAT99489.1）作为目标。选择来自红细胞的的人类硫氧还蛋白过氧化物酶B（TPx-B）（PDB ID：1QMV）的晶体结构作为模板（图1A），因为其序列与EhPrx有50.77%的相似度。

SWISS-MODEL服务器生成了EhPrx十聚体复合物的三维模型，结果显示了预期的结构特征

阿米巴培养

溶组织内阿米巴（HM1:IMSS菌株）滋养体在含有10%热灭活成年牛血清的YIMDHA-S培养基中于36.5℃下培养。培养72小时后，将滋养体冷却至4℃以促进其脱落，随后以500×g的离心力离心5分钟进行收集。收集到的细胞立即用于后续实验。

同源建模、分子对接与虚拟筛选

利用SWISS-MODEL服务器通过同源建模方法构建了溶组织内阿米巴 Prx的三维结构（GenBank登录号：GAT99489.1），并与人类相关蛋白进行了比对

讨论

本研究通过同源建模和虚拟筛选，发现Dinaciclib是一种新型的溶组织内阿米巴过氧化还原蛋白抑制剂。数据表明，Dinaciclib对EhPrx的药理抑制会导致寄生虫死亡，并表现出类似铁死亡的特征。

类似铁死亡的细胞死亡现象已在其他原生动物寄生虫中被观察到，且具有独特的分子特征[27]、[28]、[29]。例如，经典的铁死亡诱导剂RSL3能有效抑制疟原虫的生长

CRediT作者贡献声明

李文杰：撰写初稿、方法学设计、实验实施。周瑞雪：方法学设计、实验实施。戴东：实验实施。张宏泽：实验实施。冯萌：实验实施。程勋佳：撰写、审稿与编辑、项目管理、概念构思。

资金来源

本研究得到了国家重点研发计划（2018YFA0507304）和国家自然科学基金（81630057）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢复旦大学免疫学系的钱静在技术上的协助。