用于种系传递的无菌鸡宿主：禽类生物技术中受体准备策略的综述

《Protein Expression and Purification》：Sterile Chicken Hosts for Germline Transmission: A Review of Recipient Preparation Strategies in Avian Biotechnology

鸡作为重要的发育生物学和农业模型，基因组编辑技术通过生殖细胞介导方法显著提升效率。本文系统综述了物理、化学、辐射及基因去核方法，并聚焦诱导不育系统如DAZL-iCaspase9和gSAMURAI，探讨其在非鸡鸟类中的应用及未来方向。

　　

陈一辰|武本龙也

Setsuro Tech Inc.精准育种事业部精准育种开发部门，日本德岛县仓本町3-18-15，邮编770-8503

摘要

鸡（Gallus gallus）长期以来一直是发育生物学和农业领域的重要模型。最近在基因组编辑技术方面的进展，尤其是通过生殖细胞介导的技术，显著提高了转基因和基因编辑鸡的培育效率。本文综述了鸟类基因编辑的发展，包括各种用于提高生殖系传递能力的生殖细胞消融方法，以及生产不育代孕宿主的策略。我们比较了物理、化学、辐射和遗传方法在诱导生殖细胞消融中的应用，重点介绍了如DAZL-iCaspase9和gSAMURAI等新兴的不育系统。同时，我们也探讨了这些技术在非鸡类鸟类中的应用，并讨论了鸟类基因组工程和代孕宿主技术的未来发展方向。

引言

鸡（Gallus gallus）作为家禽已有数千年的驯化历史[1]。如今，鸡不仅是重要的食物来源，还提供了鸡蛋和肉类。除了其农业价值外，鸡在生物学和医学研究中也扮演着重要角色。作为卵生动物，鸡每天都会产下受精卵，大部分胚胎发育过程发生在卵内（in-ovo）。这些特性使得科学家能够方便地观察发育中的胚胎，相比哺乳动物模型具有显著优势，自古希腊时代以来，鸡胚胎就一直是发育生物学中的宝贵资源[2]。

然而，随着基因工程技术的发展，鸡模型相对于哺乳动物的局限性日益明显。尽管在研究中经常使用鸡，但生成转基因鸡仍然比哺乳动物更具挑战性。基因组修饰对于阐明基因功能和理解分子调控机制至关重要。在哺乳动物中，生产转基因动物的主要材料是单细胞胚胎（受精卵），可以通过体外受精（IVF）轻松获得。在受精卵阶段进行基因操作可以高效地培育出转基因或基因编辑动物。

相比之下，鸡卵中含有大量的不透明卵黄，使得显微操作变得困难。此外，鸟类缺乏可靠的IVF系统，也增加了获取受精卵的难度。虽然可以从产下的卵中收集早期胚胎（例如Eyal-Giladi和Kochav（EGK）X期胚胎），但这些胚胎的胚盘内已经含有3万到5万个细胞[3]。因此，与哺乳动物不同——在哺乳动物中编辑单个受精卵即可使整个个体都发生基因改变——鸟类基因组编辑通常需要操作大量细胞，从而导致效率降低和生殖系传递能力受限。如果未能成功修改具有生殖能力的细胞，基因改变将不会遗传给下一代。

为了克服鸟类基因组编辑的挑战，人们投入了大量努力来提高针对生殖细胞的编辑效率。近年来，体外操作原始生殖细胞（PGCs）在鸡中的技术已经得到广泛应用[4]。作为精子和卵子的前体，PGCs可以直接进行基因修饰，从而在后代中高效传递基因改变（图1）[5]。利用这一策略，已经开发出了多种用于生物研究的基因编辑鸡模型[6]。

为了进一步提高移植后修改过的PGCs的生殖系传递能力，研究人员培育出了不育鸡作为理想的代孕宿主。本文总结了鸡基因组编辑的过去和当前进展，重点介绍了相关方法和作为生殖系传递代孕宿主的菌株。

技术进展

鸟类基因组编辑的技术演变

十年前，由于技术限制，生成转基因鸡非常困难[8]。鸡的生理特性——即受精卵在输卵管漏斗部形成单细胞阶段，以及鸟类中的多精受精现象——给通常用于哺乳动物的受精卵介导的基因组编辑策略带来了重大障碍[9]、[10]。这些因素

鸟类中的生殖细胞介导的基因编辑

通过胚盘期病毒注射实现鸟类转基因时，成功感染PGCs可以产生转基因后代[30]、[31]。为了提高具有生殖能力的细胞的基因修饰效率，研究人员采用了荧光激活细胞分选（FACS）和磁激活细胞分选（MACS）等技术。这些方法利用表面标记物（如阶段特异性胚胎抗原1；SSEA-1）进行免疫染色来富集PGCs，并已取得成功

生殖细胞介导方法的关键挑战及技术解决方案

尽管生殖细胞介导的基因修饰具有优势，但随着该方法成为鸟类基因组编辑的主流，也出现了一些挑战。首先，PGCs介导的转基因需要宿主胚胎来接收供体PGCs，这些PGCs必须迁移并定植于生殖腺，最终分化为功能性配子[5]、[56]。然而，宿主胚胎本身含有自身的内源性生殖细胞，这些内源性细胞会与移植的供体PGCs竞争生存空间

未来方向与应用

经过数十年的研究努力，鸡的基因编辑在方法可行性和生产效率方面都取得了显著进步[6]。目前，结合不育宿主模型的生殖细胞介导的基因编辑是最具前景的策略。CRISPR/Cas系统介导的基因操作能够通过修改目标基因中的特定DNA序列实现精准育种。

作者贡献声明

陈一辰：撰写——综述与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、软件使用、资源整理、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。武本龙也：撰写——综述与编辑、项目监督、资金申请

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本文时，作者使用了ChatGPT进行英文校对以提高可读性。使用该工具/服务后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。

资金来源

本研究未获得任何公共部门、商业机构或非营利组织的资助。

利益冲突声明

陈一辰是Setsuro Tech Inc.的员工。其他作者均无利益冲突。

致谢

我们感谢Setsuro Tech Inc.的所有成员以及德岛大学胚胎学实验室的所有人员提供的帮助和有益讨论。