靶向多药耐药蛋白1柔性结构域连接子：序列选择性肽结合纳米粒子调控其功能并克服抗癌耐药的新策略

《Biomacromolecules》：Reining in Multidrug Resistance Protein 1 via Binding Its Flexible Interdomain Linker with Sequence-Selective Peptide-Binding Nanoparticles

作为编辑，我推荐这篇论文：该研究开发了序列选择性分子印迹纳米粒子（MINPs），特异性靶向多药耐药蛋白1（MRP1）连接其NBD1与TMD2的长柔性连接子（或称“缰绳”）。通过结合该蛋白膜界面附近特定序列（P1， EA938KKEETWKLM950），MINP能显著抑制MRP1的药物外排泵功能，使阿霉素（Dox）耐药的MCF-7/ADR6癌细胞对药物的敏感性恢复，IC50值降低约25%。这项工作为探索蛋白质无序区域的功能线性基序（SLiMs）和开发克服多药耐药（MDR）的新策略提供了创新工具。

　　

引言

ATP结合盒（ABC）转运蛋白是利用ATP能量跨膜转运多种分子和离子的分子机器。它们也是人类和细菌中观察到多药耐药（MDR）的主要原因。过度表达的ABC转运蛋白作为强大的外排泵，阻止药物达到其致死性细胞内浓度。MDR是抗癌治疗中产生耐药性的主要原因，占晚期癌症患者死亡率的90%以上。在ABC超家族中，多药耐药蛋白1（MRP1，由ABCC1编码）在MDR中扮演着活跃角色。该转运蛋白的特征是具有两个高度保守的核苷酸结合域（NBDs）和两个可变的跨膜域（TMDs）。开发ABC转运蛋白抑制剂面临着巨大挑战，包括广泛的药物重叠性、高细胞毒性以及MRP1跨膜域内存在多个药物结合位点带来的复杂性。抗体可用于通过直接结合蛋白质或干扰其与生物结合伙伴的相互作用来抑制蛋白质，但它们通常无法进入细胞。本研究报道了靶向人类癌细胞中MRP1的序列选择性分子印迹纳米粒子（MINPs）。这些纳米粒子通过分子印迹技术制备，能够特异性结合MRP1上连接NBD1和TMD2的长柔性连接子的不同区段。

材料与方法

材料与MINP制备

肽结合MINPs的制备过程如Scheme 1所示。简言之，在表面活性剂 1 的胶束水溶液中，加入甲基双丙烯酰胺（MBAm）、模板肽（P1–P3）和光引发剂DMPA。混合溶液经超声处理后，加入二叠氮交联剂 2、氯化亚铜和抗坏血酸钠，室温下缓慢搅拌进行“点击”反应，实现胶束表面交联。随后，反应混合物在氮气保护下，用紫外光照射进行核心交联聚合，在模板肽周围形成印迹口袋。最后，加入单叠氮化合物 5 进行进一步的表面功能化，引入亲水性配体（如磷酸盐结合胍基团）。通过透析和冻干得到最终产物。荧光标记的MINP制备过程类似，在配方中加入荧光单体 4（丽丝胺罗丹明B）或通过化合物 6 引入FITC标记。所得MINPs直径约5纳米，具有高度的序列选择性和细胞内进入能力。

细胞培养与模型建立

MDA-MB-231和MCF-7细胞系从ATCC获得，并在标准条件下培养。通过将亲本MCF-7乳腺癌细胞持续暴露于浓度逐渐增加的阿霉素（Dox）中，诱导出Dox耐药的MCF-7/ADR细胞系。诱导过程从20 nM Dox开始，逐步增加浓度至500 nM，并在350 nM Dox下维持培养以保持耐药表型。

细胞摄取与机制研究

通过荧光显微镜和流式细胞术评估MINPs的细胞摄取。实验表明，所有MINPs都能有效进入细胞并在细胞质中积累，尤其在与质膜附近共定位。使用不同的内吞抑制剂（如氯丙嗪、甲基-β-环糊精、叠氮钠/2-脱氧-D-葡萄糖等）研究了MINPs的细胞进入机制。结果显示，MINP(P1*)的摄取受甲基-β-环糊精（抑制脂筏介导的途径如膜融合和小窝蛋白介导的内吞）影响最大，而能量消耗剂（叠氮钠/2-脱氧-D-葡萄糖）也有显著抑制作用，表明MINPs通过能量依赖和能量非依赖的多种途径进入细胞。

功能与活性评估

采用一系列实验评估MINPs对MRP1功能的影响：

1. 1.
   钙黄绿素AM蓄积与逆转实验：用于评估MRP1介导的染料外排活性。钙黄绿素AM进入细胞后被酯酶水解为荧光钙黄绿素，并被MRP1外排。通过比较存在或不存在抑制剂（如丙磺舒或MINPs）时细胞内的平均荧光强度（MFI），可以衡量MRP1的抑制效果。
2. 2.
   免疫荧光与共聚焦成像：使用抗MRP1抗体对MCF-7和MCF-7/ADR细胞中的MRP1表达进行定位和定量分析，并评估MINPs与MRP1的特异性结合（通过竞争性结合实验）。
3. 3.
   细胞毒性试验（MTT法）：评估MINPs自身的细胞毒性，以及它们与Dox联合使用时对细胞活力的影响，并计算Dox的半数抑制浓度（IC₅₀）。
4. 4.
   AO/EB双染色：评估细胞膜完整性和凋亡状态，确认MINPs在测试浓度下的生物相容性。
5. 5.
   等温滴定量热法（ITC）：定量测定MINPs与其模板肽之间的结合常数（K_a）和结合自由能（-ΔG），验证其高亲和力与序列选择性。

结果与讨论

MINPs的设计、制备与表征

本研究的目标是利用肽结合MINPs逐段“扫描”MRP1上连接NBD1和TMD2的长柔性连接子（氨基酸867-956）。该连接子在MRP1的冷冻电镜结构中未被解析，属于传统生物学筛选可能忽略的区域。研究人员选择了该连接子靠近TMD2一侧的三个连续区段作为模板，合成了相应的MINPs：P1 (EA₉₃₈KKEETWKLM₉₅₀), P2 (DI₉₁₉SRHHNSTAE₉₃₁), P3 (QL₉₀₄QRQLSSSSS₉₁₅Y)。选择这些区域的原因是：1）柔性区域的肽段在印迹时更可能保持无构象状态，与MINPs的设计理念匹配；2）连接子靠近TMD2，其动态变化可能影响TMDs的开启与关闭，从而干扰转运循环；3）在此区域结合一个5纳米大小的刚性纳米粒子，有可能空间阻碍泵的构象变化；4）蛋白特有的柔性连接子可能提供更高的靶向选择性。

ITC结合数据表明，每种MINP对其模板肽的结合常数（K_a）在290至350 × 10⁴M^-1之间，结合自由能（-ΔG）约为9 kcal/mol，解离常数（K_D）约300 nM。更重要的是，MINPs对非模板MRP肽的结合非常弱，交叉反应比（CRR）在1%到3%之间，显示出优异的序列特异性。非印迹纳米粒子（NINP）的结合可忽略不计。

细胞摄取与定位

荧光成像显示，所有MINPs都能有效进入野生型MCF-7细胞。有趣的是，三种印迹纳米粒子MINP(P1)、MINP(P2)、MINP(P3)表现出独特的定位模式，在细胞质膜附近浓度较高。而对照纳米粒子NINP-G和NINP*则在细胞内随机分布。这表明MINPs在细胞内的膜富集并非仅由其表面阳离子胍基团引起，而是需要与MRP1的特异性分子识别。

对MRP1外排活性的抑制

钙黄绿素AM实验是评估MRP1活性的关键。在野生型MCF-7细胞中，MINP(P1)在10 μM浓度下抑制钙黄绿素外排的效果与阳性对照2.5 mM丙磺舒相当，使其未抑制/抑制MFI比值接近100%。而MINP(P2)、MINP(P3)以及NINPs的抑制效果则弱得多。尽管三种MINPs对其模板肽具有相似的结合亲和力，并在膜附近有相似的积累，但只有MINP(P1)表现出最强的抑制活性，这强烈表明结合位点的位置*对MRP1的功能调控至关重要。

在Dox耐药程度不同的MCF-7/ADR细胞系（ADR1至ADR6）中，MRP1的表达水平随耐药代次增加而升高（通过免疫染色证实）。相应地，这些细胞的基线未抑制/抑制MFI比值从野生型的约55%逐渐下降到ADR6代的低于20%。值得注意的是，MINP(P1)在所有代次的耐药细胞中继续发挥抑制作用，而NINP无效。虽然在高代次耐药细胞中，2.5 mM丙磺舒比10 μM MINP(P1)更有效，但比较MINP处理与未处理细胞的MFI比值提升幅度，从野生型的1.6倍增加到ADR6代的4.9倍，表明MINP(P1)在耐药细胞中抑制染料外排的相对能力更强。

特异性结合验证

免疫荧光竞争实验为MINP(P1)与MRP1的特异性结合提供了直接证据。当细胞先与FITC标记的MINP(P1)孵育，再进行MRP1免疫染色时，绿色荧光（MINP）信号强烈，而Cy5通道（抗MRP1抗体）信号大幅减弱，说明MINP的结合阻碍了抗体与MRP1的结合。相反，预先用NINP处理的细胞，则保留了强烈的抗MRP1抗体信号。定量分析荧光强度进一步证实了这一趋势。

恢复癌细胞对Dox的敏感性

MTT细胞毒性实验评估了MINP(P1)能否使细胞重新对Dox敏感。对于野生型MCF-7细胞，NINP处理或不处理纳米粒子的细胞，其Dox剂量反应曲线几乎重叠，IC₅₀值分别为93 nM和105 nM。而经MINP(P1)处理的细胞对Dox更敏感，IC₅₀值降至76 nM。对于高度耐药的MCF-7/ADR6细胞，Dox的IC₅₀值从约430 nM（NINP处理）降至330 nM，降幅约25%。通过荧光成像直接观测细胞内Dox浓度也证实，MINP(P1)处理的细胞红色荧光（Dox）强度更高，表明药物蓄积增加。

结论

本研究展示了一种利用序列选择性分子印迹纳米粒子（MINPs）作为“掩蔽试剂”，对MRP1上NBD1与TMD2之间的长柔性连接子进行逐段“扫描”的新策略。研究发现，在氨基酸938–951（P1肽段）处的MINP结合能强烈影响MRP1的药物外排活性，10 μM MINP(P1)对MCF-7细胞钙黄绿素外排的抑制效果与2.5 mM丙磺舒相当。尽管MINP(P1*)使Dox耐药细胞的IC₅₀值降低了约25%，但其致敏效果弱于一些已报道的MRP1小分子抑制剂。然而，这项研究的意义在于提供了一种探索蛋白质（尤其是膜蛋白）中传统上被视为“不可成药”的柔性无序区域功能的新工具。MINPs凭借其易于针对不同肽序列制备、高特异性结合能力以及良好的细胞穿透性，特别适用于识别内在无序蛋白区域（IDPRs）中的功能性线性基序（SLiMs）。这类区域占人类蛋白质组氨基酸的37–50%，但研究和靶向难度大。本文所阐述的序列扫描策略，有望在基础生物学研究和潜在药物开发中成为研究此类蛋白质的有用手段。