利用联合常温机械灌注和RNA干扰技术预防急性T细胞介导的排斥反应

《TRANSPLANTATION》：Preventing Acute T Cell–Mediated Rejection Using Combined Normothermic Machine Perfusion and RNA Interference Technologies

基因工程沉默HLA分子可降低器官移植T细胞介导排斥。研究显示siRNA-Chol通过外源常温机器灌注（NMP）靶向β2微球蛋白和CIITA转录因子，在肾移植模型中延长生存期至10天，改善肾功能并抑制炎症因子。相较于慢病毒载体，siRNA递送更安全但需提升基因沉默持久性。

　　

利用基因工程技术沉默捐赠器官中的人类白细胞抗原分子，以实现免疫耐受性，可能是降低T细胞介导的排斥反应风险的有效方法。T细胞介导的排斥反应是由于宿主T细胞识别移植器官内皮细胞上表达的主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类分子的非自身变异所引起的。¹其特征是淋巴细胞浸润肾小管、间质或动脉内膜。小干扰RNA（siRNA）通过破坏mRNA并减少蛋白质翻译来沉默相关基因。²它们可以被设计用来靶向MHC I类和MHC II类分子。siRNA于1998年被首次开发出来，但由于其在递送、稳定性和效率方面的问题，一直未能广泛应用于临床实践。²在细胞外环境中，核酸酶或酶可能会降解这些RNA，从而影响其稳定性。可以通过对siRNA的磷酸骨架、核糖或碱基进行化学修饰来提高其稳定性和效率。²将siRNA与胆固醇结合是已知最有效的化学修饰方法之一。³

目前，体外常温机器灌注（NMP）在肾脏移植中的应用越来越受到关注，作为一种替代低温保存的方法。人们认识到NMP为向隔离的器官输送治疗药物提供了理想的条件。⁴这可以避免受体受到任何潜在的全身性影响。通常使用基于红细胞的溶液在接近或正常的体温下对器官进行灌注。⁵这种灌注方式有助于恢复器官的细胞功能，从而使得在灌注过程中施加的药物能够被有效利用。 Lin等人⁶研究了靶向β2微球蛋白和II类主要组织相容性转激活因子（CIITA）的siRNA-Chol的应用。β2微球蛋白是所有有核细胞上表达的MHC I类分子的一个组成部分，由B2M基因编码；CIITA则是负责MHC II类分子表达的转录因子。他们在37°C的NMP条件下，使用自体全血溶液对啮齿动物的肾脏进行了3小时的siRNA-Chol处理。^{6处理后，这些肾脏被移植到基因不匹配的受体动物体内，模拟急性排斥反应模型。结果发现，与静态低温保存组（使用siNC-Chol）相比，接受siRNA-Chol处理的肾脏存活时间更长：处理组存活了10天，而对照组仅存活了8天。这表明NMP本身可能就有助于减少急性排斥反应，可能是通过减少移植器官中的白细胞数量实现的。处理组肾脏在移植后第6天和第7天的血清肌酐水平更低，肾功能也有所改善。组织学检查显示肾脏结构得到了更好的保护，肾小管炎、肾小球病变和周围肾小管毛细血管炎的情况也有所减轻。移植后第3天，处理组肾脏中的B2M和CIITA表达水平低于对照组。蛋白质表达水平和流式细胞术分析也证实了这一点，即MHC I类和II类分子的表达减少。然而到第7天时，处理组与对照组之间的差异不再显著，MHC分子的表达重新出现。此外，处理组肾脏中的T细胞和B细胞数量减少，促炎细胞因子下调，抗炎细胞因子上调，IgG和IgM抗体水平也有所下降。siRNA-Chol具有良好的安全性，没有引起组织损伤或形态改变，组织完整性也未受影响。还有部分肾脏在NMP过程中接受了siNC-Chol-Cy5荧光标记处理，这些动物在移植后第3天仍然存活，进一步验证了siRNA-Chol在肾脏中的靶向效果。 其他研究还表明，结合慢病毒载体的RNA能够更持久地下调MHC分子的表达。Yuzefovych等人将编码β2微球蛋白和CIITA的短发夹RNA（shRNA）通过慢病毒载体在亚低温体外灌注过程中递送到肾脏中。7移植后6周，β2微球蛋白和CIITA的转录水平降低了70%。虽然细胞因子水平有所变化，但未观察到细胞毒性。Figueiredo等人通过慢病毒转导短发夹RNA在体外肺灌注中实现了猪白细胞抗原的永久性下调，同样靶向β2微球蛋白和CIITA的mRNA，从而降低了猪异体肺移植的排斥反应发生率。接受处理的肺脏的受体在移植后产生的供体特异性抗体和促炎细胞因子水平也较低。值得注意的是，在2年的监测期间，部分动物无需免疫抑制即可存活。 虽然Lin等人的研究结果并不完全新颖，效果也可能不如前述研究显著，但这是首次使用急性排斥模型来评估siRNA-Chol的效果。该研究提供了强有力的证据，证明siRNA-Chol在预防T细胞介导的急性排斥反应方面的有效性。与病毒载体相比，“裸”RNA的使用具有更低的脱靶效应。病毒载体在免疫功能低下的受体中存在较高的免疫原性和致突变风险。 将这一研究成果转化为临床应用还有很长的路要走，需要开发出更持久的策略。作者提出，他们的siRNA疗法可能有助于在移植初期减少免疫抑制，从而减少副作用和并发症，这是合理的。未来的研究需要探索延长基因抑制效果的策略，并在更具临床意义的模型中进行验证。 总之，利用机器灌注技术递送siRNA是一种有前景的方法，可以通过靶向MHC I类和II类分子的表达来降低器官的免疫原性。}