靶向转录因子AbaA：抑制真菌产孢和提升作物安全性的新策略

《Phytopathology Research》：Targeting the transcription factor AbaA: a potential strategy for inhibiting fungal conidiation and enhancing crop safety

本文是一项关于新型抗真菌策略的原创研究。研究聚焦于土传病原真菌尖孢镰刀菌，其引起的枯萎病严重威胁多种重要经济作物。针对传统杀菌剂靶向细胞基本进程、易导致抗药性快速产生的局限，作者创新性地将控制真菌无性产孢（分生孢子形成）的关键转录因子FolAbaA作为靶点。通过虚拟筛选，研究者鉴定出两种小分子化合物G305-0126和8019-6157，它们能特异性地破坏尖孢镰刀菌番茄专化型的产孢过程，且不影响菌丝基础生长。实验证实这两种化合物可直接与FolAbaA结合，并下调三个关键的产孢相关下游基因。此外，化合物对稻瘟病菌和灰葡萄孢菌也表现出广谱抗真菌活性，且对处理后的植物幼苗无药害。这项研究确立了FolAbaA作为开发新型杀菌剂的有望靶点，为深入阐明产孢调控网络奠定了基础，为开发更具选择性、环境友好且不易引发抗药性的下一代作物保护剂提供了新思路。

　　

背景

病原真菌对全球粮食安全和生态稳定构成严重威胁。尖孢镰刀菌是一种广泛分布的土传病原真菌，能引起番茄、香蕉、西瓜等超过120种重要经济作物的毁灭性枯萎病。在其侵染循环中，尖孢镰刀菌会产生三种类型的无性孢子：小分生孢子、大分生孢子和厚垣孢子。其中，分生孢子是主要的侵染繁殖体，促进病害传播；而厚垣孢子则使其能在土壤中长期存活。这些无性孢子的数量直接决定着病害爆发的传播速度和严重程度。因此，破坏病原菌的无性繁殖可以极大地降低其成功致病的风险。

多年来，真菌产孢的调控机制已得到广泛研究。在曲霉属中，BrlA–AbaA–WetA通路是调控无性发育的核心通路。值得注意的是，AbaA同源物在镰刀菌中功能保守且对产孢不可或缺。在禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌古巴专化型和番茄专化型中，删除AbaA基因会完全消除产孢能力，从而明确证实了其在该过程中的关键作用。尽管AbaA对镰刀菌产孢至关重要，但其精确调控下游过程的机制仍不清楚。

目前，镰刀菌属病害的防治严重依赖广谱杀菌剂。这些传统化学药剂通过破坏真菌的基本代谢来有效降低病害严重度，但其过度使用导致了抗药性发展、对非靶标生物的不利影响、生态负担等一系列重大挑战，其中抗药性被认为是主要限制因素。因此，开发针对关键致病生命周期阶段的精确干预手段对于可持续农业至关重要。与靶向生命基本过程的传统杀菌剂不同，靶向产孢调控因子（如AbaA）不仅能阻断病原菌传播，还能通过避免对成熟菌丝体施加致死压力来减轻选择压力。此外，其高度特异性可最大限度地减少对非靶标生物的附带损害。

结果

通过文库筛选鉴定出化合物G305-0126和8019-6157作为Fol产孢抑制剂

鉴于破坏无性繁殖的关键调控因子可大幅减少繁殖体产量并减轻病害严重度，研究者选择FolAbaA作为化学筛选的靶点。FolAbaA属于TEA/ATTS转录因子家族，含有一个保守的N端DNA结合TEA结构域。利用SWISS-MODEL预测的FolAbaA结构，研究者确定了该结构域内一个表面暴露的裂隙，该裂隙位于α-螺旋束和插入的β-折叠之间的界面，其结构排列与其他TEA家族成员中观察到的DNA结合沟一致，因此预测其参与DNA识别。重要的是，该裂隙代表了一个潜在的变构位点，小分子对其调节可能会改变DNA结合的亲和力或特异性。

通过使用Glide对ChemDiv化合物库进行计算机虚拟筛选，初步鉴定出8个可能靶向FolAbaA的化合物。随后通过标准产孢抑制实验评估了这8种化合物对尖孢镰刀菌番茄专化型产孢的抑制效果。其中，化合物G305-0126和8019-6157能有效抑制分生孢子的产生。分子对接分析预测了这些活性化合物与FolAbaA的潜在结合模式。G305-0126似乎与Asn93（形成两个氢键）和Met94（形成一个氢键）形成氢键，并与Lys82和Phe83发生疏水相互作用。而化合物8019-6157主要与Lys82、Phe83、Asn93和Arg128形成疏水相互作用。

G305-0126和8019-6157对Fol产孢的抑制作用

小分生孢子是尖孢镰刀菌番茄专化型中主要的无性分生孢子。为评估化合物G305-0126和8019-6157的生物学活性，研究者首先测定了它们抑制产孢的半最大效应浓度（EC₅₀）。结果显示，G305-0126和8019-6157的EC₅₀值分别为1.827 μM和0.8849 μM。

先前研究表明，FolAbaA基因缺失突变体无法产孢，但菌丝生长没有缺陷。为了进一步表征FolAbaA，研究者在多种培养和胁迫条件下评估了该突变体的表型。与之前的研究结果一致，该突变体在菌丝生长或胁迫响应方面未显示出显著缺陷。研究者还评估了两种化合物的特异性，结果表明G305-0126和8019-6157对菌丝生长或孢子萌发均未表现出明显的抑制作用。这些结果表明，这些化合物特异性地靶向尖孢镰刀菌番茄专化型的无性繁殖途径。

为了确定G305-0126和8019-6157是否与FolAbaA发生物理相互作用，研究者进行了表面等离子共振（SPR）实验。考虑到SPR分析对固定化蛋白的大小高度敏感，大蛋白会产生最小的相对质量变化和较差的信噪比，因此研究集中于包含虚拟筛选中确定的配体结合裂隙的N端TEA结构域（第1-211位氨基酸）。His标签的FolAbaA_1-211及相关丙氨酸突变体在大肠杆菌中表达并纯化。SPR结果证实了两种化合物均可直接与野生型FolAbaA_1-211蛋白结合，平衡解离常数（K_D值）分别为2.52e^-7mol/L和1.37e^-6mol/L。相比之下，当测试针对关键相互作用残基被丙氨酸取代的FolAbaA突变蛋白时，结合亲和力分别显著降低至3.27e^-4mol/L和1.20e^-3mol/L。总之，这些结果确立了G305-0126和8019-6157是通过直接与FolAbaA相互作用来抑制尖孢镰刀菌番茄专化型产孢的强效且特异性抑制剂。

为了评估这些化合物是否具有广谱活性，研究者比对了几种代表性病原真菌（尖孢镰刀菌番茄专化型、禾谷镰刀菌、稻瘟病菌和灰葡萄孢菌）AbaA抑制剂结合口袋的氨基酸序列。结果显示，抑制剂结合口袋在尖孢镰刀菌番茄专化型和禾谷镰刀菌中完全相同，这表明这些化合物可能对这两个物种具有相当的活性。因此，研究者选择了系统发育上较远的病原菌灰葡萄孢菌和稻瘟病菌进行进一步测试。G305-0126和8019-6157均能强烈抑制灰葡萄孢菌和稻瘟病菌的产孢，EC₅₀值范围在3.26至8.32 μM之间。与在尖孢镰刀菌番茄专化型中的观察结果一致，在测试的任何真菌物种中均未观察到对营养生长的抑制作用。这些发现表明，G305-0126和8019-6157是前景广阔的广谱抗真菌候选物，能特异性靶向无性繁殖而不损害真菌生长。

AbaA调控的产孢基因及其对化合物的转录响应

尽管真菌产孢的上游调控机制已相对明确，但涉及的具体下游基因仍不清楚。ΔFolAbaA突变体中产孢的完全缺失，强烈暗示转录因子FolAbaA是该过程的主调控因子。研究者假设化合物G305-0126和8019-6157通过干扰FolAbaA功能来抑制产孢，从而抑制关键的产孢下游基因的表达。为验证这一假设，研究者在产孢早期收集了野生型和ΔFolAbaA突变体的菌丝进行RNA-seq分析。差异表达分析显示，与野生型相比，突变体中有743个基因上调，718个基因下调。鉴于ΔFolAbaA中完全缺乏孢子产生，研究者假设对产孢至关重要的基因很可能是那些表达严重下调的基因。因此，选择了三个假定的FolAbaA调控基因进行进一步验证，分别是编码TULIP家族脂质结合蛋白的FOXG_02495、编码含WSC结构域蛋白的FOXG_04089和编码糖苷水解酶16家族蛋白的FOXG_14735。qRT-PCR分析证实，这三个基因的转录本水平在ΔFolAbaA突变体中均显著低于野生型。

随后，研究者调查了这些化合物对FolAbaA的化学抑制是否会影响这些基因的表达。在产孢期间用G305-0126或8019-6157处理的野生型菌丝中，FOXG_02495、FOXG_04089和FOXG_14735的表达被强烈下调，这与观察到的孢子产量减少一致。此外，为了评估这些化合物对植物体内产孢的影响，研究者检测了受感染番茄幼苗中孢子特异性标记基因FOXG_10061的表达。两种化合物均显著降低了植物体内FOXG_10061的表达，从而表明宿主内的产孢大幅减少。鉴于产孢直接由AbaA控制，这种抑制反映了在侵染期间对AbaA依赖性产孢的靶向抑制。

总之，这些结果表明G305-0126和8019-6157通过与FolAbaA结合并破坏其激活关键下游产孢基因（包括FOXG_02495、FOXG_04089和FOXG_14735）表达的能力，来抑制尖孢镰刀菌番茄专化型的产孢。

FolAbaA调控的基因是产孢所必需的

为了确定上述鉴定的FolAbaA调控基因是否在功能上是产孢所必需的，研究者为三个候选基因分别构建了缺失突变体和相应的遗传互补株系。表型分析显示，与野生型菌株相比，缺失FOXG_02495或FOXG_04089均显著减少了产孢量，而ΔFOXG_14735突变体的产孢水平与野生型相当，无统计学显著差异。所有突变体均表现出正常的营养生长和孢子形态。遗传互补完全恢复了ΔFOXG_02495和ΔFOXG_04089突变体的产孢能力。这些结果证明，FOXG_02495和FOXG_04089是FolAbaA重要的下游靶标，直接介导尖孢镰刀菌番茄专化型的产孢。

G305-0126和8019-6157不会对幼苗造成可检测的形态损伤

鉴于G305-0126和8019-6157能特异性抑制多种真菌病原体的产孢而不影响营养生长，研究者接下来评估了它们对寄主植物的潜在植物毒性。用30 μM（高于其抗产孢EC₅₀值）的每种化合物处理番茄、菜豆、棉花和水稻幼苗14天。值得注意的是，在任何处理过的植物中均未观察到形态异常，如生长迟滞或叶片褪绿。无植物毒性，加上对真菌繁殖的选择性抑制，突显了G305-0126和8019-6157作为选择性作物保护剂的潜力，它们能靶向病原菌传播而不伤害寄主植物。

讨论

杀菌剂抗性是对全球作物保护日益严峻的挑战。传统的镰刀菌杀菌剂主要靶向包括细胞分裂、膜生物合成和能量产生在内的基本真菌过程。其广泛使用对真菌病原体施加了强大的选择压力，导致抗性快速发展。本研究证明了靶向关键产孢调控因子而非核心代谢途径来开发新型抗真菌剂的可行性。研究者鉴定出两种强效的小分子抑制剂（EC₅₀值在低微摩尔范围），它们通过靶向FolAbaA，特异性地破坏尖孢镰刀菌番茄专化型的产孢，且不影响基础真菌生长。至关重要的是，这些化合物对稻瘟病菌和灰葡萄孢菌的广谱功效，加上其无植物毒性，展示了它们作为新型、环境相容性抗真菌剂的潜力。从机制上讲，研究者鉴定了三个AbaA调控的、对产孢至关重要的下游基因，从而确认了靶点结合，并揭示了产孢调控网络的关键组成部分。

分生孢子是病原真菌传播和侵染起始的主要繁殖体。因此，靶向产孢必需基因代表了一种有前景的抗真菌病替代策略，可能减轻由传统杀菌剂驱动的抗性进化。BrlA–AbaA–WetA核心通路在这一过程中起着关键作用。尽管真菌间无性繁殖的调控存在差异，但AbaA在子囊菌亚门中尤为保守。先前研究表明，在尖孢镰刀菌番茄专化型中删除AbaA会完全消除产孢，但不影响菌丝生长、形态或胁迫响应。这一发现与在禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌古巴专化型中的观察结果一致。此外，研究者观察到灰葡萄孢菌和稻瘟病菌也对化合物G305-0126和8019-6157有响应，产孢量急剧减少。总之，这些发现确立了AbaA作为镰刀菌病原体中产孢的保守且不可或缺的核心调控因子。至关重要的是，AbaA对传播至关重要，但对营养生长并非必需。这种严格的特异性将AbaA定位为一个有前景的抗真菌靶点，既能阻断传播，又能规避驱动抗性进化的致死选择压力。

AbaA在子囊菌亚门中广泛保守，但其抑制剂结合口袋中的关键残基在不同物种间存在差异。G305-0126和8019-6157对灰葡萄孢菌和稻瘟病菌具有活性，这两个物种分别保留了尖孢镰刀菌番茄专化型中存在的四个和三个关键残基。这种部分保守性可能解释了它们的跨物种活性。尽管该口袋在其他物种中差异更大，但即使有限地保留这些残基也可能带来脱靶效应的风险。为了将此类风险降至最低，未来的工作应侧重于通过基于结构的优化提高选择性、通过靶向递送限制环境暴露，以及在现实的农业条件下评估这些化合物对有益真菌的生态毒性。

尽管在许多真菌中，控制无性繁殖的调控网络已得到很好的表征，但对产孢至关重要的下游基因的功能表征仍然有限。在本研究中，基于RNA-seq分析选择了三个推测参与产孢的基因（FOXG_02495、FOXG_04089和FOXG_14735）进行功能验证。结果表明，敲除FOXG_02495或FOXG_04089中的任何一个都会大幅减少孢子产量，证实了它们在此过程中的关键作用。FOXG_02495编码一个TULIP家族脂质结合蛋白，该超家族内的蛋白质通过脂质传感和运输促进多种代谢过程。值得注意的是，在构巢曲霉和稻瘟病菌中，脂质相关蛋白的缺失已被证明会消除产孢能力。同样，FOXG_04089的必要性与细胞壁完整性（CWI）信号通路的重要性一致，该通路是细胞壁生物合成的关键途径。破坏作为CWI关键组分的质膜传感器蛋白已知会损害产孢。相比之下，删除FOXG_14735并未导致产孢缺陷。然而，其受FolAbaA的转录调控以及对生物活性化合物的反应性，提示其可能参与此过程。这种表型的缺失与糖苷水解酶家族中功能冗余的报告一致，其中单个基因的缺失由于其他成员的补偿作用而不会导致分离缺陷。总之，这些发现揭示了三个具有不同产孢作用的FolAbaA调控基因。对剩余的FolAbaA调控基因的进一步研究将增进我们对植物病原真菌产孢机制的理解。

结论

本研究确立了FolAbaA作为抗真菌药物发现的有望靶点。鉴定出的化合物G305-0126和8019-6157通过直接结合FolAbaA并抑制关键的下游基因，特异性抑制了尖孢镰刀菌番茄专化型的产孢。它们对稻瘟病菌和灰葡萄孢菌的功效，加上无植物毒性，为开发能减轻抗性、支持可持续作物保护的新型杀菌剂奠定了基础。