生物反应器驱动的细胞外囊泡规模化生产与下游功能工程

《Health Nanotechnology》：Bioreactor-enabled extracellular vesicle production for downstream functional engineering

本研究系统比较了传统培养瓶、双层膜生物反应器与中空纤维生物反应器在细胞外囊泡（EVs）生产中的表现，揭示了中空纤维系统在产量、资源效率及可工程化方面的显著优势，为EVs的临床转化提供了高产、可扩展且兼容下游功能修饰的平台解决方案。

　　

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles， EVs）作为由细胞分泌的、携带蛋白质、脂质和核酸的脂质双层包被颗粒，在生理和病理信号传导中扮演着关键角色，并在再生医学、靶向药物递送和疫苗开发领域展现出巨大潜力。然而，EVs的临床转化长期受限于其生产效率和分离后修饰（post-isolation engineering）方法的低效性。因此，开发能够同时支持大规模可靠生产与下游修饰的高密度生物反应器系统成为了迫切需求。

引言

研究背景指出，当前EV生产的金标准是二维培养瓶（Conventional Flasks， CF），但其受限于表面积和资源消耗强度。相比之下，生物反应器因其连续收获、高密度培养和减少资源消耗的潜力而成为更优选择，特别是能最大限度减少细胞机械扰动的中空纤维生物反应器（Hollow-Fiber Bioreactor， HFB）和双层膜生物反应器（CELLine Bioreactor， CLB）。本研究旨在系统地表征和比较CF、CLB和HFB系统在EV产量、粒径分布、表面标志物、蛋白组学特征、形态以及工程化可行性方面的表现，以评估其作为符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）的、可扩展、面向转化的EV生产平台的潜力。

材料与方法

本研究使用人胚肾细胞（HEK293FT）作为EV生产细胞。实验比较了三种培养系统：标准175 cm²培养瓶（CF）、CLB 1000 AD生物反应器和C5011中空纤维生物反应器（HFB）。细胞在生物反应器中的接种、适应和维持遵循特定流程，培养基成分从含血清逐渐过渡到化学成分确定的血清替代培养基（CDM-HD），以适应无血清培养条件。常规培养则作为对照在六孔板中进行。

EV的分离和纯化采用差速超速离心法，分别获得大EVs（LEVs， 20，000 × g离心30分钟）、小EVs（SEVs， 167，000 × g离心4小时）、外来体（exomeres， 167，000 × g离心16小时）和超聚体（supermeres， 303，000 × g离心19.5小时）。随后，粗提的EV沉淀物经尺寸排阻色谱（SEC）进一步纯化。

EV的表征采用了多种技术：通过扫描电子显微镜（SEM）观察生物反应器生长表面的结构；通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）测量纯化后颗粒的粒径分布和浓度，并进行统计学分析；通过免疫印迹（Immunoblotting）检测经典EV标志物（GRP94、GAPDH、CD81）；通过无标记蛋白质组学分析（LC-MS/MS）比较不同来源EV的蛋白表达谱，并进行基因本体（GO）富集分析；通过透射电子显微镜（TEM）观察EV的形态。此外，研究还评估了EV的工程化可行性，合成了聚乙二醇-聚丙烯硫醚（PEG-PPS）微胶束（Micelles， MCs），并通过孵育或超声处理，将荧光分子（Cy3或AlexaFluor555）负载到EV内部（EV-MC cargo-loading）或修饰到其表面（EV-MC surface-modification），并利用NTA的检测限来验证EV-MC杂交的成功。

结果

不同条件下的EV产量

研究结果显示，在归一化到系统级产出的前提下，无论是LEV还是SEV，HFB和CLB每次收获所回收的颗粒数量均显著高于CF。具体而言，HFB产生的SEV颗粒数量显著高于CF（p < 0.05）。尽管两种生物反应器的产量随时间点存在波动，但其LEV和SEV产量始终与CF相当或更高。将产量归一化到每毫升培养基时，CLB、HFB和CF的平均产量分别为2.81 × 10¹⁰、6.39 × 10¹⁰和2.19 × 10⁸particles/mL，HFB优势明显。对不同周次的粒径分布进行稳定性分析发现，各平台内部及平台之间的粒径分布存在统计学上的显著差异，但其差异幅度（以Earth Mover‘s Distance， EMD衡量）很小，表明生物反应器平台能稳定地产出粒径特征一致的EVs。

EV鉴定与蛋白质组学分析

免疫印迹分析显示，在所有EV样品中均能观察到约22 kDa处的CD81条带，该条带在细胞裂解物中缺失，证实了所分离颗粒的EV属性。约37 kDa处的GAPDH条带在除HFB-SEV外的所有样品中可见，而约94 kDa的GRP94条带在所有EV样品中均未检测到。蛋白质组学分析表明，尽管蛋白质上样量相同，但CF来源的EVs鉴定到的蛋白质数量始终少于生物反应器来源的EVs。主成分分析（PCA）和t分布随机邻域嵌入（t-SNE）显示，生物反应器来源的EV样品与CF来源的EV样品在蛋白表达谱上存在明显区分，而CLB和HFB来源的样品则更为接近。对变异最显著的蛋白质进行的GO富集分析显示，显著富集的条目均集中在细胞组分（Cellular Component）类别，包括内质网膜、线粒体、线粒体内膜和线粒体基质，未发现与应激反应相关的典型通路富集。透射电镜图像确认了来自各平台的LEV和SEV具有典型的EV形态，并且生物反应器也能大规模产生外来体（exomeres）和超聚体（supermeres）。

EV工程化

研究评估了两种工程化策略：通过EV-MC杂交进行货物装载（cargo-loading）以及通过MC携带分子的后插入进行表面修饰（surface-modification）。所使用的MCs粒径（约20-30 nm）小于NTA仪器的检测限（约50 nm）。工程化处理后，EV的粒径分布未发生显著改变，但颗粒计数有小幅增加，这被归因于检测到了与EV杂交的MCs。荧光检测结果显示，仅经过工程化处理的EV样品检测到了荧光信号，而单独的EV和MC对照组均为非荧光，这证实了工程化处理成功地将荧光分子引入了EV。透射电镜图像进一步支持了杂交结构的形成。

讨论

本研究将产量比较聚焦于系统级产出和资源效率，而非单位细胞的固有生产力。与CF相比，HFB的EV产量实现了数量级的提升，这与先前关于高密度培养系统能大幅提高EV产出的报告一致。粗略的成本效益分析显示，生物反应器系统每美元培养基所产生的EV数量（约10¹⁰–10¹¹）比CF（约10⁹）高出一个数量级。尽管生物反应器的资本和耗材成本更高，但其支持连续、高密度培养、减少人工和处理需求的能力，使得其长期运行的总体成本效率优于传统培养瓶。此外，生物反应器的半封闭设计降低了污染风险，更符合EV标准化和转化指南中强调的生产原则。

尽管免疫印迹结果存在条带强度差异，且缺乏通用的EV管家蛋白作为上样对照，这反映了该领域的普遍挑战，但多指标表征（粒径、形态、标志物组）证实了生物反应器能够稳定生产具有典型特征的EVs。蛋白质组学差异更多地反映了细胞对不同培养环境的代谢适应，而非应激诱导的EV成分系统性改变，这为针对特定应用优化EV谱提供了可能。

本研究的一个核心动机是验证生物反应器提高的产量是否转化为更实用的EV工程化。结果表明，整个研究期间的所有工程化实验消耗的EV总量不到单个生物反应器总产量的8%（v/v）。这种规模在使用传统培养瓶时难以实现。更重要的是，生物反应器来源的EVs在工程化方面没有表现出任何内在限制，它们与孵育或超声等工程化协议兼容。因此，工程化EV产出的主要瓶颈在于可用于修饰的EV绝对数量，而这恰恰是生物反应器可以解决的。

研究还创新性地利用了NTA仪器的检测限来验证EV-MC杂交的成功，因为游离的MCs因尺寸过小无法被NTA检测。检测到的荧光信号未伴随EV粒径分布的显著偏移或展宽，进一步支持了荧光来源于EV-MC杂交，而非非特异性吸附。据我们所知，这是首次报道EV-MC杂交的实验证据。

结论

本研究系统比较了传统培养瓶与生物反应器系统的EV生产能力。研究证明，中空纤维生物反应器系统能大幅提高EV产量，同时降低操作负担，凸显了此类平台在cGMP导向生产中的巨大潜力。研究进一步表明，从生物反应器收获的EVs保留了经典的表型特征和工程化效能。由于所有工程化实验仅消耗了总EV产量的一小部分，本研究的结果直接解决了起始材料有限这一关键挑战。综上所述，生物反应器平台，特别是中空纤维系统，为连接实验室规模的EV研究与临床相关生产提供了一座可扩展的转化桥梁。