《The Journal of Headache and Pain》：Downregulation of neuronal DRD2 drives microglia synaptic pruning and results in cognitive deficits by promoting CCL2 release in a rat model of chronic migraine
编辑推荐：
本研究首次揭示了在慢性偏头痛（CM）中，海马神经元多巴胺D2受体（DRD2）下调如何通过释放CCL2这一关键趋化因子，进而过度激活小胶质细胞的突触吞噬功能，最终导致突触丢失和认知障碍。文章创新性地提出了“神经元DRD2–CCL2–小胶质细胞吞噬–突触丢失”这一全新病理轴，为理解CM相关认知功能障碍的机制提供了新视角，并提示靶向DRD2–CCL2–CCR2通路有望成为治疗CM认知损伤的新策略。
慢性偏头痛（CM）是一种致残性神经系统疾病，其与认知缺陷和潜在的痴呆风险增加之间的联系日益受到关注。虽然小胶质细胞介导的突触修剪与认知能力下降有关，但其在CM中的作用尚不完全清楚。多巴胺D2受体（DRD2）对认知功能至关重要，并已被证明会影响突触修剪。本研究旨在探究DRD2信号如何在CM中影响小胶质细胞的吞噬功能和突触完整性。
认知缺陷和海马齿状回神经元DRD2表达降低在CM大鼠模型中被观察到
通过硬脑膜重复输注炎性汤（IS）建立了CM大鼠模型。与假手术组相比，模型大鼠的机械痛和热痛阈值显著降低，三叉神经尾侧核（TNC）中降钙素基因相关肽（CGRP）蛋白水平显著升高，证实了中枢敏化的成功诱导。同时，模型组大鼠海马区DRD2的mRNA和蛋白表达水平显著下降，免疫荧光定位显示DRD2主要在神经元（NeuN+）中表达，其减少在海马CA1区和齿状回（DG）亚区尤为明显，其中DG区的下降最为显著。在认知行为测试中，模型大鼠在Morris水迷宫（MWM）测试中表现出更长的逃避潜伏期、在目标象限停留时间更短、平台穿越次数更少，并且更倾向于使用非空间搜索策略；在新物体识别测试（NORT）中，模型大鼠对新物体的探索减少，辨别指数和差异评分显著降低。这些结果表明，IS大鼠海马DG神经元DRD2表达减少，并伴有空间学习和非空间识别记忆的损伤。
DRD2缺陷诱导海马小胶质细胞激活和过度的突触吞噬
对野生型（WT）和DRD2敲除（KO）小鼠的海马组织进行全转录组基因表达分析发现，DRD2 KO小鼠的海马在神经炎症通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用以及小胶质细胞功能相关通路（如“吞噬体”通路）上显著富集。基因本体（GO）分析进一步证实了DRD2 KO海马中涉及小胶质细胞激活、吞噬作用和趋化因子反应过程的富集。在DRD2 KO小鼠中，免疫荧光标记显示DG区IBA1+小胶质细胞数量虽无变化，但形态变为阿米巴样，Sholl分析显示其分支更短、交叉点更少，反映了细胞复杂性降低和形态活化。对突触标记物PSD95的评估显示，DRD2 KO小鼠小胶质细胞内PSD95+斑点的数量以及斑点体积占小胶质细胞体积的比例均显著增加，表明针对突触后成分的吞噬活性增强。
小胶质细胞吞噬激活和突触丢失确实存在于雄性CM大鼠模型的海马DG区
Western印迹结果显示，与假手术组相比，CM组大鼠海马中的突触后蛋白PSD95显著减少，而突触前标志物SYP（synaptophysin）的表达无显著变化。高尔基染色进一步表明，IS大鼠海马DG区的树突棘密度降低。免疫荧光分析显示，虽然DG区IBA1+细胞数量无显著差异，但CM组小胶质细胞呈现活跃的阿米巴样形态，细胞体更大、突起更少，Sholl分析证实其分支更短、交叉更少、复杂性降低。用脂多糖（LPS）刺激BV-2小胶质细胞模拟炎症环境后，CD68（吞噬活性标志物）荧光强度显著增加。在IS大鼠中，CD68+小胶质细胞的数量也显著高于假手术组，表明吞噬活性增强。这些发现证实，IS大鼠海马DG区神经元DRD2的下调导致了突触丢失、小胶质细胞激活和吞噬功能亢进。
神经元DRD2调节小胶质细胞吞噬激活并促进突触修剪以影响CM大鼠模型的认知表现
为了阐明DRD2在CM模型突触修剪和认知功能中的作用，我们向CM模型大鼠分别给予了DRD2激动剂奎吡罗（Quinpirole）、拮抗剂舒必利（Sulpiride）或DMSO溶剂。Western印迹分析显示，与CM+DMSO组相比，奎吡罗给药显著减轻了海马PSD95的下降，而舒必利则进一步降低了PSD95水平。高尔基染色表明，奎吡罗部分恢复了DG区的树突棘密度，而舒必利加剧了脊柱丢失。免疫荧光评估显示，与CM+DMSO组相比，奎吡罗组CD68+小胶质细胞数量显著减少，小胶质细胞内PSD95+吞噬囊泡的数量减少，吞噬PSD95的体积比例也显著降低。相反，舒必利组显示CD68+细胞数量增加，小胶质细胞内含PSD95的吞噬囊泡相应增多。在认知行为测试中，接受奎吡罗治疗的大鼠在MWM训练中逃避潜伏期更短，在目标象限停留时间更长，游泳总距离更长，并且在NORT中表现出更高的辨别指数和差异评分。总体而言，DRD2激活通过抑制小胶质细胞吞噬作用减少突触丢失，从而改善CM引起的认知缺陷；而DRD2拮抗可能促进小胶质细胞介导的突触吞噬，增加突触修剪。
CM大鼠神经元中DRD2的下调促进CCL2释放增加
为了阐明神经元DRD2与小胶质细胞吞噬激活之间相互作用的分子机制，我们聚焦于突触修剪关键介质的转录调控。DRD2敲除小鼠和CM大鼠模型的转录组研究均强烈提示趋化因子的表达和功能。DRD2缺陷显著增加了CCL2的mRNA表达。在CM大鼠模型中的qPCR验证显示，与假手术组相比，CM组海马CCL2转录水平显著升高。免疫荧光分析显示，与假手术组相比，CM组DG神经元中CCL2荧光强度显著增加。进一步的免疫荧光结果显示，DRD2激动剂奎吡罗处理降低了CM大鼠神经元中的CCL2荧光，而拮抗剂舒必利则增加了神经元中的CCL2表达。趋化因子CCR2（CCL2的受体）在小胶质细胞中高表达。结果表明，在CM病理条件下，CCL2表达在海马DG神经元中特异性升高，而DRD2信号通路在转录水平上直接抑制了这一过程。
CCR2抑制剂消除了由DRD2抑制剂诱导的小胶质细胞吞噬活性和突触丢失
神经元CCL2在激活和招募吞噬细胞、导致突触消除中起着至关重要的作用。CCL2通过趋化因子CCR2促进小胶质细胞激活和增殖。为了确定神经元CCL2是否通过CCR2触发CM模型中小胶质细胞的吞噬激活和随后的突触丢失，我们向CM大鼠模型侧脑室给予了CCR2抑制剂INCB3344，并评估了海马突触丢失和小胶质细胞吞噬激活。Western印迹显示，INCB3344组减轻了IS大鼠海马突触蛋白的下降。高尔基染色证实，与CM组相比，INCB3344组的树突棘密度得到恢复。这些发现表明，阻断CCL2受体CCR2有助于防止IS大鼠海马的突触丢失。为了探索CCL2是否是DRD2神经元调节小胶质细胞吞噬激活和突触修剪的关键因子，我们在向CM模型大鼠侧脑室给予INCB3344前一小时，通过尾静脉给予舒必利。Western印迹和高尔基染色结果显示，舒必利阻断了INCB3344的突触保护作用。此外，免疫荧光分析显示，与CM组相比，INCB3344组CD68+小胶质细胞数量显著减少，表明吞噬活性降低。通过3D重建和表面渲染评估小胶质细胞内突触标记物PSD95的荧光信号，发现INCB3344组小胶质细胞内含有的PSD95+蛋白更少，其体积占小胶质细胞体积的比例也更低，这损害了小胶质细胞吞噬PSD95的能力。然而，舒必利逆转了INCB3344对小胶质细胞吞噬和突触修剪的抑制作用。这些发现证实，在CM大鼠模型中，神经元DRD2表达与CCL2释放相关，CCL2影响小胶质细胞CCR2，从而促进小胶质细胞激活并导致过度的突触修剪。
米诺环素通过抑制胶质细胞介导的过度突触修剪改善CM大鼠模型的认知缺陷
先前的研究表明，米诺环素（minocycline）可抑制小胶质细胞的吞噬活性，从而防止精神分裂症和狼疮小鼠模型中的突触丢失和认知障碍。鉴于IS大鼠中报告的小胶质细胞吞噬激活和突触丢失，我们研究了米诺环素是否能改善这些动物的记忆缺陷。免疫印迹分析显示，与接受PBS的IS大鼠相比，米诺环素治疗显著增加了海马PSD95的表达。给予米诺环素后，高尔基染色显示齿状回内的树突棘密度更高。Sholl分析显示，米诺环素处理的动物比CM+PBS对照组有更多的小胶质细胞交叉。此外，免疫荧光标记显示，米诺环素组海马DG区CD68阳性（IBA1+）小胶质细胞数量显著减少。通过3D重建和表面渲染技术测量小胶质细胞内突触标记物PSD95的荧光信号，结果显示米诺环素组小胶质细胞的突触吞噬作用更少，小胶质细胞内的PSD95+囊泡也更少，同时小胶质细胞体积比例下降，表明有效抑制了过度的突触修剪。最终的认知行为评估表明，与CM+PBS组相比，米诺环素治疗的动物在MWM中逃避潜伏期更短，目标象限停留时间更长，平台穿越次数更多。在NORT阶段，米诺环素组倾向于识别新物体，表现为更高的辨别指数和差异评分。数据表明，米诺环素治疗减少了IS诱导的IS大鼠海马小胶质细胞激活和吞噬作用，恢复了海马DG区的突触连接，并改善了IS大鼠的认知行为。数据还表明，小胶质细胞吞噬激活对于IS大鼠的突触丢失和认知缺陷至关重要。
本研究首次揭示，在慢性偏头痛中，海马神经元DRD2的下调会通过增加趋化因子CCL2的释放，促进小胶质细胞对神经突触的吞噬，从而介导突触消除机制。反复的IS刺激特异性地导致了海马（尤其是DG区）DRD2水平降低、突触后密度蛋白PSD95减少、小胶质细胞吞噬活性增强以及记忆缺陷。值得注意的是，这些效应可被DRD2激动剂奎吡罗逆转性地预防。此外，奎吡罗治疗显著减轻了IS引起的认知缺陷。这些发现不仅为CM相关认知功能障碍的机制提供了新的解释，也提示靶向DRD2–CCL2–CCR2通路可能是治疗CM认知损伤的一个有前景的新策略。
