SIMPLseq：一种高灵敏度的恶性疟原虫基因分型及PCR污染检测工具

《Malaria Journal》：SIMPLseq: a high-sensitivity Plasmodium falciparum genotyping and PCR contamination tracking tool

疟原虫基因分型新方法SIMPLseq通过6-locus小面板实现高灵敏度检测（≥0.5 parasites/μl），并集成污染检测系统。相比4CAST方法，其检测率提升且可准确识别人为及意外污染。适用于重复感染分类、多克隆性估计及干预试验终点分析，仅需开源试剂无需预扩增步骤。

　　

摘要

背景

通过聚合酶链反应（PCR）扩增子测序（AmpSeq）进行病原体基因分型是一种有用的疾病监测工具。已经开发了多个包含100多个多重PCR扩增子的大型AmpSeq面板，作为全基因组测序（WGS）方法的替代方案，用于检测引起疟疾的疟原虫物种，特别是在追踪寄生虫耐药性和分析亲缘关系方面。然而，对于寄生虫载量低于10个/μl的样本，这些大型多重测序通常会产生稀疏的数据。针对低寄生虫载量基因分型优化的小型多重测序方法在方法学上研究不足，但具有潜在的多种重要应用场景。在PCR过程中管理污染风险是AmpSeq领域需要关注的另一个关键方法学问题。

方法

在这里，我们描述了一种新的6位点恶性疟原虫 AmpSeq“迷你多重测序”（SIMPLseq），该测序方法针对高灵敏度分析进行了优化，并整合了一种基于特定内联条形码的污染检测系统，该条形码在第一轮PCR（PCR1）过程中应用；此外，在第二轮PCR过程中还进行了常规的索引步骤。我们使用公开可用的WGS数据来评估该测序面板的多样性，并使用模拟样本来评估其相对于之前描述的4CAST迷你多重测序方法的灵敏度和精确度。我们还故意制造了污染事件，以评估污染检测的严谨性，并在马里收集的疟疾感染干血斑样本上进行检测时估计非故意污染的发生率。

结果

SIMPLseq在计算机模拟中显示出较高的单倍型多样性，能够区分从12个次国家级样本集中随机抽取的96.0%的样本对。在灵敏度分析中，SIMPLseq的表现优于4CAST：在寄生虫载量≥0.5个/μl时，平均位点检测率达到100%；在寄生虫载量≥0.25个/μl和≥0.125个/μl时，平均位点检测率分别达到≥50%；在1%的检测限下，25次重复实验中均未出现假阳性单倍型。当采用“哨兵”设计（即六个多重PCR1引物对中的一个包含特定序列对）时，内联条形码对产量没有显著影响。在PCR1产物处理过程中故意引入的24次污染事件中，哨兵条形码均被正确识别；在马里进行的1420个样本检测中，还识别出了39次非故意污染。

结论

SIMPLseq显著扩展了疟疾基因组流行病学工具包，将高灵敏度的恶性疟原虫基因分型与PCR污染检测结合在一起，采用了一种简单的实验室协议，该协议仅使用开源试剂，且不需要昂贵的预扩增步骤。SIMPLseq的关键潜在应用场景包括复发感染分类、多克隆性估计以及将基因型感染终点应用于干预效果试验。