《Drug Testing and Analysis》：Annual Banned-Substance Review 18th Edition—Analytical Approaches in Human Sports Drug Testing 2024/2025
编辑推荐：
这篇综述系统回顾了2024年10月至2025年9月期间发表的关于运动兴奋剂检测方法的前沿文献，聚焦于世界反兴奋剂机构(WADA) 2025年禁用清单下的各类违禁物质与方法。文章重点探讨了合成代谢剂（如类固醇、选择性雄激素受体调节剂(SARMs)）、肽类激素、基因兴奋剂（包括基于寡核苷酸的化合物）等关键领域的最新分析策略、代谢研究与检测技术进展，并强调了不断演进的检测挑战与持续研发的重要性。
在过去的一年（2024年10月至2025年9月）里，运动反兴奋剂研究领域继续蓬勃发展，重点关注新的药物实体、药物代谢与消除，以及给药途径对分析检测结果的影响，旨在确保及时开发出能够为常规兴奋剂控制应用提供相关测试程序和分析数据的方法。
1 引言
运动兴奋剂是一个复杂的现象，无数来自不同科学学科的研究对其进行了探讨。研究发现，运动员的易感性、自恋与自我同情、追求完美主义，以及内在的反兴奋剂态度等因素，都与他们使用非法手段提升表现的倾向相关。尽管运动员通常合法使用营养补充剂，但产品被违禁物质污染导致不良分析结果(AAFs)的报道屡见不鲜，例如含有生长因子残留的肉类或含有天然违禁成分的中成药。此外，非故意接触违禁物质的情况也需要在分析灵敏度与选择性之间取得平衡，以最小化与兴奋剂场景无关的AAFs。
作为全球反兴奋剂努力的核心，基于分析化学的运动兴奋剂检测方法不断演进。色谱-质谱联用系统目前仍是主流，其性能优于基于生物传感器的潜在替代方案。同时，使用干血斑(DBS)样本的趋势日益明显，其采集策略、样本质量以及适用于精英运动员和公众健康调查的分析方法都得到了广泛研究。
2025年世界反兴奋剂机构(WADA)的禁用清单保持了其11类禁用物质(S0-S9加上P1)和3类禁用方法(M1-M3)的结构。相对于2024年版清单，2025年的修订主要为特定部分增加了更多示例，例如在S0类中增加了兰尼碱受体-钙稳定蛋白复合物稳定剂S-107和ARM 210，在S4.2中增加了抗雌激素药物elacestrant等。
2025年的监测计划继续记录特定物质的使用模式，其中包括蜕皮甾酮(ecdysterone)在尿液中的流行情况，研究表明其能显著刺激C2C12肌管肥大并增加胰岛素样生长因子I (IGF-I) mRNA表达。此外，对胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)受体激动剂（如司美格鲁肽(semaglutide)）的监测也在继续，考虑到其对体重管理的潜在影响，以及与肌生长抑制素-激活素通路抑制剂和/或合成代谢剂联合使用的可能性。
2 未经批准的物质
此类物质（S0类）指那些符合WADA禁止标准但未被其他任何类别覆盖、且尚未获得任何政府卫生监管机构批准用于人类治疗的化合物。随着一些S0类候选物（如BPC-157、兰尼碱受体-1-钙稳定蛋白复合物稳定剂、肌钙蛋白激活剂）的可用性和（临床前）数据的增加，及时更新检测方法对于常规兴奋剂控制至关重要。例如，对于肌钙蛋白激活剂reldesemtiv和tirasemtiv，新研究提供了其在大鼠体内的生物转化产物信息，为人类运动兴奋剂检测应用补充了数据。
3 合成代谢剂
合成代谢雄激素类固醇(AAS)和选择性雄激素受体调节剂(SARM)的使用带来了从公共健康到体育诚信等多方面的挑战。同时，与非故意接触相关的AAFs似乎仍主要与合成代谢剂有关，这表明了进行全面的兴奋剂控制和优化检测方法的重要性。
3.1 合成代谢雄激素类固醇
关于AAS的反兴奋剂研究趋势持续聚焦于深入理解其代谢、优化生物标志物的纵向监测、使用补充性样本基质（如毛细血管血），以及区分内源性天然类固醇与其合成类似物的新方法。
3.1.1 初始检测程序与代谢研究
对AAS及其代谢物进行灵敏、稳健的分析需要持续研究。例如，研究人员重新审视了口服美雄酮(metandienone)在人体内的生物转化，证实了17α-羟甲基-17β-甲基-18-去甲-5β-雄甾-1,13-二烯-3α-醇等代谢物的排泄，其检测窗口期表明对运动兴奋剂检测具有相当长的追溯性。对氧甲氢龙(oxymetholone)和美睾酮(methasterone)的体内外代谢比较研究发现，靶向特定的羟基化或去甲基代谢物可提供长达50天以上的检测窗口期。对甲基屈他雄酮(methyltrienolone)的体外代谢研究发现其可能形成17-羟甲基-18-去甲类似物，这可能是一个重要的长期代谢物标志。
除了传统的液相萃取(LLE)和GC-MS方法，新技术如液相色谱-离子淌度高分辨质谱(LC-IM-HRAM)被用于非靶向代谢组学分析，以帮助发现未知代谢物。合成参考物质的制备与评估也是研究的一部分，例如通过定量核磁共振谱和液相色谱对特定类固醇代谢物参考品进行表征。
3.2 类固醇谱分析与尿液和/或血液检测
通过运动员生物护照(ABP)的类固醇模块，可以检测像睾酮(T)这样的伪内源性物质。研究发现，对于口服十一酸睾酮(T undecanoate)的干预，在常用的类固醇标志物中，5α-雄烷二醇/表睾酮(5αAdiol/E)比值在识别类固醇谱变化方面表现最佳。同时，靶向磺酸化类固醇，如5α-雄烷-3β,17β-二醇硫酸盐/脱氢表雄酮(DHA)硫酸盐和表雄酮(epiA)硫酸盐/DHA硫酸盐比值，能提供更长的检测窗口期（可达144小时）。
直接证明内源性类固醇外源性来源的同位素比值质谱(IRMS)技术持续发展。虽然液相色谱-同位素比值质谱(LC-IRMS)的灵敏度目前仍不及气相色谱-燃烧-同位素比值质谱(GC/C/IRMS)，但其无需衍生化的特点使其成为现有方法的潜在补充。
靶向血液样本（血清或DBS）中的睾酮酯已被证明是一种有效的替代方法。实验室间研究证明，在DBS中可检测到低至2 ng/mL的睾酮丙酸盐、苯丙酸盐、癸酸盐和十一酸盐。不同的采样卡、提取溶剂和衍生化试剂都会影响各分析物的检测限(LOD)，因此需要针对不同目标物优化方法。
3.3 其他合成代谢剂
其他合成代谢剂（如克伦特罗和各类SARMs）在2023年共导致173例AAFs。对新出现的SARMs（如LY305和S42）进行了代谢研究，发现了多种羟基化、脱氢和葡萄糖醛酸化代谢物。对于SARM S-23的研究表明，即使摄入低至1微克的剂量，在尿液中也可追溯长达253小时，而连续5天摄入50微克则可将检测窗口延长至平均544小时。透皮接触SARMs的研究也表明，不同给药途径会影响检测窗口期，这在后续结果解释中需要考虑。
4 肽类激素、生长因子、相关物质及模拟物
4.1 促红细胞生成素受体激动剂与低氧诱导因子激活剂
促红细胞生成素(EPO)受体激动剂(ERAs)继续在WADA的AAFs统计数据中占据重要地位。基于抗体的免疫亲和纯化策略是检测rhEPO及其类似物的核心。新开发的抗体（如MAIIA anti-EPO antibody 7D3）和基于磁性纳米颗粒的纯化方法被证明能有效从尿液或血液中捕获ERAs，且成本效益可能更优。研究表明，即使是单次15 IU/kg体重的rhEPO微剂量，也能在尿液和DBS中被检测到。
为防止因罕见但天然存在的人源EPO变体(VAR-EPO)干扰rhEPO检测结果的判读，研究人员开发了特异性抗体和反向-正向免疫纯化流程，可几乎完全从尿液中去除VAR-EPO。此外，针对在尿样中掺入口腔液以图干扰检测的样本操纵行为，研究人员建立了通过检测唾液富含脯氨酸蛋白(saPRPs)特异性肽段来揭露此类行为的方法。
间接的、基于生物标志物的检测方法也在探索中。研究发现，在施用ERAs后，血清中的肌苷和次黄嘌呤等代谢物的丰度会发生显著变化，提示其作为潜在生物标志物的价值。
对于新型EPO模拟物如培莫沙肽(pegmolesatide)，研究人员开发了基于重组EPO受体修饰的磁性纳米颗粒捕获结合纳米液相色谱-高分辨质谱(nanoLC-HRMS)检测的直接分析方法，检测限为2 ng/mL，适用于常规兴奋剂控制。
低氧诱导因子(HIF)激活剂（如罗沙司他(roxadustat)、钴、氙）也是禁用物质。研究表明，接触钴或氙会导致血液中与HIF-1α转录因子调控相关的特定微小RNA（如hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-378a-3p）表达发生显著变化，这为潜在的间接检测提供了新思路。
4.2 睾酮刺激肽（男性）与生长激素、其类似物及释放因子
对于睾酮刺激肽（如曲普瑞林(triptorelin)）在体内代谢稳定性的研究，有助于延长其在尿液和血清中的检测窗口期。对生长激素(GH)及其类似物和释放因子的检测方法也在不断优化，以满足日益复杂的兴奋剂控制需求。
