《Nano Select》：Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles Functionalized With Therapeutic Agents: Synthesis, Characterization, and In Vitro Evaluation for Biomedical Applications
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本研究综述了超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPIONs)经谷胱甘肽(GSH)功能化后，作为药物递送平台搭载合成抗炎药双氯芬酸钾(DP)和天然产物苦姜(BG)的研究。通过共沉淀法合成磁铁矿(Fe3O4)核心，并利用油酸涂层防止团聚。利用FTIR、PXRD、TEM、VSM及DLS等技术系统表征了纳米颗粒的结构、形貌、磁学性质及胶体稳定性。体外MTT实验在含/不含胎牛血清(FBS)条件下评估了纳米载体对健康肺成纤维细胞(MRC-5)和癌细胞(HeLa)的细胞毒性，结果表明在生理相关条件下纳米系统展现出良好的生物相容性。本研究为开发靶向、可控的药物递送系统提供了多功能纳米平台，在炎症性疾病及肿瘤治疗领域具有应用潜力。
引言
炎症性疾病是全球最常见的健康状况之一，通常需要长期的药物干预。非甾体抗炎药(NSAIDs)如双氯芬酸因其强效的镇痛和抗炎活性而被广泛使用，但长期给药常伴随胃肠道、心血管和肾脏的不良反应，这限制了其治疗窗口，并推动了更安全替代品或优化药物递送系统的开发。近年来，天然产物作为具有抗炎潜力和较低全身毒性的生物活性化合物来源日益受到关注。生姜和苦瓜是两个显著的例子，在临床前研究中已显示出抗氧化、抗菌和抑瘤特性。纳米技术为克服传统药剂的局限性提供了创新策略。在此背景下，超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPIONs)因其生物相容性、磁响应性以及与治疗分子功能化的潜力而成为高度通用的载体。其纳米级尺寸赋予了独特的理化性质，包括高比表面积、增加的化学反应性以及增强的光学、机械和热学特性。SPIONs作为诊断、靶向药物递送和癌症治疗的平台脱颖而出。本研究旨在解决两个主要研究目标：第一是通过Fe(II)和Fe(III)盐的共沉淀法合成和表征磁铁矿SPIONs，随后用谷胱甘肽(GSH)等生物相容性含硫醇配体进行表面功能化；第二是将治疗剂，特别是合成NSAID双氯芬酸钾(DP)和来自苦姜(BG)的天然植物提取物，负载到功能化的SPIONs上，并在健康和肿瘤细胞系上进行体外细胞毒性测定。
结果与讨论
成功的合成和表面功能化是确保SPIONs稳定性、生物相容性和适用于生物医学应用的关键步骤。本研究采用的共沉淀路线产生了具有窄尺寸分布和高结晶度的磁铁矿纳米颗粒。后续的表面修饰能够可控地引入可与治疗分子相互作用的官能团。油酸涂层有效防止了合成过程中的颗粒团聚，促进了与谷胱甘肽(GSH)的配体交换并增强了在水性介质中的分散。重要的是，硫醇化配体不仅增强了胶体稳定性，还引入了反应性的─SH基团，作为连接DP和苦姜(BG)等生物活性化合物的锚定位点。
FTIR光谱通过识别纳米颗粒表面分子的特定振动带，为成功的功能化提供了进一步证据。谷胱甘肽的FTIR光谱在2520 cm?1处显示一个特征带，这是─SH基团伸缩振动模式的特征。SPIONs:GSH样品的FTIR光谱在1705 cm?1(C═O)以及1587和1529 cm?1(─COO?)处显示出GSH的特征带，表明谷胱甘肽分子与纳米颗粒表面之间存在吸附型相互作用。此外，2520 cm?1处对应于谷胱甘肽硫醇基团的谱带证实了SPIONs表面存在游离的─SH基团。对于双氯芬酸钾(DP)，其纯药光谱显示出特征谱带，如3246 cm?1处的N─H伸缩振动、1574和1377 cm?1处的羧酸根基团不对称和对称伸缩振动、1489 cm?1处芳香环C═C键的伸缩振动等。最终载药复合物(SPIONs:GSH:DP)的谱图显示出DP药物的所有主要特征峰，特别是3246 cm?1处的N–H伸缩、1489 cm?1处的芳香C═C伸缩和743 cm?1处的C─Cl伸缩，明确证实了双氯芬酸钾成功负载到SPIONs:GSH纳米平台上。苦姜(BG)提取物的FTIR光谱显示出其特征谱带，如3287 cm?1处的O─H伸缩振动、2927 cm?1处烷基的C─H伸缩振动、1639 cm?1处共轭羰基的伸缩振动等。SPIONs:GSH:BG样品的谱图中可以观察到GSH和BG的特征带，表明存在可能的吸附。
PXRD分析进一步证实了成功功能化。图2显示了铁氧化物纳米颗粒的PXRD图谱。在粉红色谱线(SPIONs:GSH)中，可以同时观察到磁铁矿和谷胱甘肽的峰，表明三肽可能吸附在SPIONs表面。在紫色谱线(SPIONs:GSH:DP)中，除了磁铁矿衍射峰，谷胱甘肽的特征峰不再被检测到，取而代之的是与药物相关的峰，表明药物成功锚定在纳米颗粒表面。对于BG功能化的样品也可以进行类似的解释。Rietveld精修图显示，SPIONs-GSH样品显示出SPIONs和GSH两者的晶体贡献，其中GSH重量约占89%。将DP锚定到SPIONs-GSH系统后，与GSH相关的晶体峰消失，这可能是由于合成过程中其结构无序或相对含量减少所致。此外，物相定量表明DP在SPIONs表面过量约91 wt%。
透射电子显微镜(TEM)图像揭示了功能化纳米颗粒的形貌和尺寸分布。SPIONs:GSH:DP样品的TEM图像显示纳米颗粒近似球形，具有多分散的尺寸分布。观察到一定程度的聚集，可能是由于表面相互作用所致。高分辨率成像揭示了磁铁矿明确定义的晶面，证实了纳米颗粒的结晶性和有序的晶格结构。SPIONs:GSH:BG样品的TEM图像显示纳米颗粒呈球形，尺寸范围为5至15 nm，分布相对均匀。聚集体的存在表明，尽管进行了功能化，颗粒之间残余的相互作用仍然存在，这可能被植物提取物的有机成分增强。
磁学测量揭示了纳米颗粒的超顺磁行为。在300 K（超顺磁区域）下测量的磁滞回线显示，所有样品在移除磁场后剩余磁化强度降至零（矫顽场近似为零），表现出清晰的超顺磁行为。用BG包覆的纳米颗粒显示出较低的磁化强度，可能是由于非磁性分子尺寸较大所致。
通过DTNB滴定法量化了纳米颗粒表面的游离SH基团，发现谷胱甘肽包覆的SPIONs中SH含量约为1.15 ± 0.06 mmol g?1。动态光散射(DLS)和Zeta电位分析用于评估纳米颗粒在水性分散体中的胶体稳定性。所有样品的流体动力学尺寸约为120 ± 5 nm，多分散指数(PDI)较低，为0.29 ± 0.07，表明尺寸分布均匀。此尺寸大于X射线衍射和透射电镜获得的数据，这是由于纳米颗粒周围存在水分子（溶剂化）、溶剂化离子以及由强吸引力（如范德华力、耗尽力和疏水相互作用）引起的聚集所致。Zeta电位测量值约为-25.0 ± 3.0 mV，表明系统具有合理的胶体稳定性。负表面电荷有助于颗粒间的静电排斥，从而减少广泛聚集；然而，由于残余吸引力，仍可能形成小的聚集域。
采用MTT细胞活力测定法在生物环境中测试样品，该方法通过测量线粒体代谢活性来评估细胞活力。根据ISO 10993–5:2009标准，与阴性对照相比，细胞活力超过70%的系统被认为是可行的。研究在有无10%胎牛血清(FBS)补充的培养基条件下，评估了不同磁性纳米颗粒配方对HeLa（肿瘤）和MRC-5（健康成纤维细胞）两种代谢谱不同细胞系的细胞毒性影响。
在不含FBS的条件下，所有样品均导致细胞活力显著下降，在HeLa细胞中尤其对于纯SPIONs和SPIONs:GSH，其值低于70%。这种细胞毒性的增加可能与表面反应性增加和氧化应激有关，这可能与铁介导的氧化还原过程相关。具有强烈糖酵解代谢和高线粒体电位的HeLa肿瘤细胞对氧化应激更为敏感，这强化了恶性细胞在低抗氧化剂水平环境下的差异敏感性。相比之下，MRC-5细胞的活力维持在70%阈值附近，这可能与代谢调节和纳米颗粒内化效率的差异有关。将GSH引入纳米颗粒表面导致了复杂的生物反应。虽然GSH是重要的细胞内抗氧化剂，但先前研究表明，在某些条件下，其与铁基纳米材料的相互作用可能参与氧化还原循环过程。同样，双氯芬酸钾的存在可能有助于细胞应激反应。含有苦姜提取物(SPIONs:GSH:BG)的样品显示出细胞毒性的部分减弱，此行为可暂时归因于文献中描述的具有抗氧化和金属螯合特性的生物活性化合物的存在。
在补充了10% FBS的系统中，观察到相反的行为：所有样品显示出大于70%的活力，在某些浓度下接近或高于100%，表明毒性显著减弱。这种差异可以通过蛋白质冠的立即形成来解释，蛋白质冠覆盖纳米颗粒表面并重新定义其生物身份。蛋白质（主要是白蛋白和免疫球蛋白）的吸附提供了空间稳定作用，减少了聚集，并防止了颗粒与细胞膜的直接接触，从而实现了更好的生物相容性。有无FBS条件的比较表明，在没有蛋白质的情况下观察到的毒性源于纳米颗粒与细胞的直接相互作用，而在有FBS存在时，生物-纳米界面发生了重组，从而降低了表面反应性和氧化应激。总体而言，MTT测定结果表明，GSH和BG功能化的SPIONs在生理相关条件下表现出良好的胶体稳定性和生物相容性之间的平衡。
结论
本工作中获得的结果证明了合成、功能化和表征谷胱甘肽包覆并功能化了双氯芬酸钾(DP)和天然化合物苦姜(BG)的超顺磁氧化铁纳米颗粒(SPIONs)的有效性。结构、形态、磁学和生物学分析表明，纳米颗粒表现出超顺磁行为、高胶体稳定性和有前景的生物活性特性，证明了其在生物医学应用中的潜力。作为初步研究，采用MTT测定法评估了细胞活力，以验证配方的初始细胞相容性，并确定健康和肿瘤细胞中的一般反应趋势。结果表明，在生理相关条件（存在FBS）下，非肿瘤细胞具有低细胞毒性，而肿瘤细胞具有依赖于配方的反应谱，支持了这些纳米结构作为有前景的药物递送系统的潜力。尽管取得了这些进展，但仍需要进一步的研究来加深对涉及的生物学机制的理解、优化浓度、评估释放曲线并探索特定的细胞-纳米颗粒相互作用参数。总的来说，这项研究有助于纳米医学领域创新纳米结构系统的理性发展，强化了SPIONs作为治疗和诊断应用多功能平台的潜力，特别是作为更深入的生物学和功能研究的基础。
实验部分
4.1 合成
SPIONs采用共沉淀法制备。首先，将FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O等铁(II)和铁(III)盐在酸性水介质中混合，并加入弱碱如氢氧化铵(NH4OH)。生成的固体用油酸包覆以增强胶体稳定性并防止团聚。
4.2 SPIONs的硫醇化配体功能化与药物负载
合成旨在修饰最初用油酸涂层稳定的SPIONs。该层通过使用谷胱甘肽(GSH)作为硫醇化配体进行配体交换而被取代。对于交换，将干燥的SPIONs分散在甲苯中，并与溶解在二甲基亚砜(DMSO)中的GSH混合，测试了SPIONs与配体质量比为1:5和1:10的情况。1:10的比例提供了最有效的表面功能化。然而，在纯DMSO中长时间搅拌（14小时）会导致凝胶状沉淀的形成，这个限制通过在交换反应前将GSH溶解在水中而成功克服。表面修饰后，GSH包覆的SPIONs进一步用两种活性剂功能化：双氯芬酸钾(DP)和苦姜(BG)。对于DP负载，将10.8 mg GSH-SPIONs分散在5 mL水中，并与溶解在5 mL 1 M乙酸中的21.6 mg DP混合。对于GA负载，将50 mg GSH-SPIONs分散在5 mL Milli-Q水中，并与溶解在5 mL Milli-Q水中的250 mg GA混合。两个反应均在室温下搅拌14小时。随后通过磁性倾析分离所得的功能化纳米颗粒，洗涤并真空干燥。
4.3 表征技术
4.3.1 傅里叶变换红外光谱(FTIR)
使用配备金刚石ATR附件的Agilent Cary 630光谱仪进行FTIR测量。光谱在400–4000 cm?1范围内记录，光谱分辨率为4 cm?1，累计512次扫描。分析前，将样品精细研磨以获得均匀粉末，随后在紫外光下干燥15分钟。
4.3.2 粉末X射线衍射(PXRD)
使用STADI-P衍射仪在透射模式下进行粉末X射线衍射，样品置于两个醋酸纤维素薄膜之间。仪器设置为40 kV和40 mA，并配备Ge (111)单色器以提供AgKα1辐射（λ = 0.55941 ?）。使用Mythen2 1K探测器在2θ范围4°–50°内收集数据，步长为0.015° (2θ)，每个3.15°角的积分时间为120秒。使用TOPAS-Academic V7软件分析所得数据，通过Rietveld精修量化物相。晶体结构参考自无机晶体结构数据库(ICSD)，并使用QualX2软件，该软件使用内部晶体学开放数据库(COD)版本。
4.3.3 透射电子显微镜(TEM)
使用Talos F200X G2透射电子显微镜检查超顺磁纳米颗粒的形态和粒径分布，该显微镜配备冷场发射枪(FEG-X)、扫描透射(STEM)模式和高分辨率TEM (HRTEM)功能。对于样品制备，首先将纳米颗粒分散在乙醇中，并将上清液的一小部分滴加到涂有无定形碳膜的铜网上。通过测量大约250个纳米颗粒来确定尺寸分布和平均颗粒直径。
4.3.4 磁化测量
使用配备振动样品磁强计(VSM)的Quantum Design Ever Cool II PPMS系统在300 K下研究磁学性质。记录磁化曲线作为外加磁场的函数，范围从-0.3到0.3 T。所有测量均在干燥粉末上进行，将其轻轻压实并放入圆柱形Lucite支架中。
4.3.5 SPIONs上游离硫醇基团的定量
通过与5,5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应，然后进行紫外-可见分光光度检测，定量表面硫醇(–SH)基团。游离硫醇与DTNB反应生成5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB2?)，其在412 nm处显示特征吸光度（ε = 11,400 M?1cm?1）。在典型实验中，将10 mg纳米颗粒分散在1.5 mL TBE缓冲液(Tris–borate–EDTA)中，并与200 μL DTNB溶液（5.07 mmol L?1，溶解在含1 mmol L?1EDTA的TBE缓冲液(pH 8.3)中）混合。孵育5分钟后，离心悬浮液，并将上清液转移到石英比色皿中，使用紫外-可见分光光度计测量吸光度。所有实验进行三次，并计算标准偏差。
4.3.6 动态光散射(DLS)和Zeta电位
使用ALV/CGS-3紧凑型测角仪系统通过动态光散射确定流体动力学尺寸分布，该系统配备22 mW线性偏振He–Ne激光器（λ = 633 nm）、ALV 7004数字相关器和一对在伪交叉相关模式下运行的雪崩光电二极管。在90°散射角记录自相关函数，并使用累积量方法分析。使用Zetasizer Nano ZS通过电泳光散射(ELS)进行Zeta电位测量。对于两种分析，样品制备方法是将约10 mg纳米颗粒在25 ± 1°C下超声处理分散在20 mL去离子水中。
4.3.7 生物学测定
MRC-5细胞（人胎儿肺成纤维细胞）和HeLa细胞系肿瘤细胞在补充了10%胎牛血清以及青霉素（10,000 μ mL?1）和链霉素（10,000 μg mL?1）抗生素溶液的DMEM中，于37°C、含5% CO2的气氛中培养。细胞维持至达到90%汇合度，然后以1:3的比例通过胰蛋白酶消化传代。
使用MTT比色法评估细胞活力，该方法基于活细胞通过线粒体酶琥珀酸脱氢酶代谢还原MTT盐的能力。盐的还原促进蓝紫色甲臜晶体的形成，这些晶体积累在细胞质中。将细胞以每孔10,000个细胞的浓度铺在96孔板中，并在任何实验前孵育24小时。24小时后，用先前溶解在纯DMEM中的样品（SPIONs、GSH、DP、BG、SPIONs:GSH、SPIONs:GSH:DP和SPIONs:GSH:BG）处理细胞，进行系列稀释（不同浓度）。样品孵育24小时。孵育期后，用PBS洗涤细胞，并加入200 μL浓度为0.1 mg mL?1的MTT溶液。将板在37°C、5% CO2的潮湿气氛中避光保持4小时。随后，用200 μL二甲基亚砜(DMSO)替换MTT溶液以溶解甲臜晶体，并将板震荡15分钟以确保完全溶解。使用自动酶标仪在波长λ = 570 nm处进行吸光度测量。
