Chelex-100热裂解技术与冻干LAMP技术的结合，用于快速实现肝手术后手术部位感染的即时检测

《Analytica Chimica Acta》：Integration of Chelex-100 Thermal Lysis and Lyophilized LAMP for Rapid Point-of-Care Detection of Surgical Site Infections Following Liver Surgery

手术部位感染（SSI）相关病原体在复杂腹腔引流液（ABDF）中的快速检测平台开发及临床验证。通过优化Chelex-100热裂解结合冻干LAMP试剂，构建1小时内完成DNA提取与多重病原体联检的POC系统，灵敏度≤103 CFU/mL，临床准确率超98%。

　　

黄伟|黄俊峰|程建文|杨柳晓|周健|王婷|杨新荣|隋国栋

上海复旦大学环境科学与工程学院大气颗粒物污染与防治重点实验室（LAP3），中国上海200433

摘要

背景

手术部位感染（SSI）是肝脏手术后一种严重且可能致命的并发症，通常与医院内细菌（如Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Enterococcus faecalis和Enterococcus faecium）有关。为了解决在复杂的腹腔引流液（ABDF）中快速现场诊断这些感染的关键需求，我们开发了CTL-SSI-LAMP平台，这是一种新型的即时检测系统，它独特地将Chelex-100热裂解（CTL）DNA提取技术与冻干环介导等温扩增（LAMP）技术结合在一起。

结果

优化的CTL方法利用Chelex-100树脂吸附抑制剂并通过热处理实现高效细胞裂解，能够在15分钟内从ABDF样本中快速提取DNA，且所需设备极少。优化后，冻干SSI-LAMP检测方法的分析灵敏度低于10³ CFU/mL，并具有令人满意的分析特异性，这一点通过模拟和真实的ABDF样本得到了验证。整个检测过程大约需要1小时完成，无需专门的实验室设备。在临床队列研究中，该平台对这四种SSI相关细菌的临床灵敏度为100%，临床特异性超过97%，阴性预测值为100%，总体准确率超过98%。

意义

CTL-SSI-LAMP平台提供了一种快速、便携且无需培养的方法，可以直接从术后ABDF中检测主要的SSI相关细菌。通过结合强大的样本预处理技术和冻干试剂，该平台能够及时进行针对性的抗菌治疗，非常适合在重症监护室、手术室和资源有限的临床环境中使用。

引言

手术部位感染（SSI）是肝脏手术（如肝切除术（LR）和肝移植术（LT）后最常见的医院获得性感染（HAIs）之一[1]。作为重大的全球公共卫生问题，SSI与高发病率和死亡率、住院时间延长、患者巨大的心理压力以及经济负担相关[2]、[3]。几乎所有接受肝脏手术的患者都需要进行术前或术后的胆道引流，从而导致胆汁被污染或感染[4]。据报道，LR和LT后的SSI发生率分别为3.1–14%和10–37%[5]、[6]。LT受者由于手术复杂性、肝胆道的处理以及免疫抑制剂的使用，特别容易发生SSI[7]。SSI通常涉及手术部位的深层组织（即胆道系统和肝血管），导致严重的并发症，如胆管炎、腹膜炎甚至严重的肝脓肿，这往往需要导管引流和长期的抗生素治疗[7]。导致肝脏手术后SSI的主要病原体是革兰氏阴性肠杆菌科菌株和鲍曼不动杆菌菌株，以及革兰氏阳性肠球菌菌株[5]。然而，由于多种天然和获得性耐药机制的日益普遍，准确识别这些病原体对于避免抗生素滥用至关重要[8]。

K. pneumoniae和肠球菌菌株最近被确认为LT受者预后不良的重要因素[9]。此外，耐碳青霉烯的A. baumannii（CRAB）感染在SSI病例中也有报道，其死亡率显著更高[10]。因此，快速准确地识别ABDF样本中的SSI相关病原体对于及时和适当的抗生素治疗至关重要，从而确保患者的成功治疗。目前，ABDF样本通过显微镜检查后进行琼脂平板培养，这至少需要3天[11]。聚合酶链反应（PCR）也被广泛使用，但需要复杂的设备和耗时的步骤，包括DNA提取和扩增，整个过程超过3小时[12]。这些延迟可能导致肝脏手术后的抗生素使用不当，从而恶化患者预后并增加发病率和死亡率。因此，迫切需要一种快速、现场且高度特异的检测平台，用于检测ABDF样本中的SSI相关细菌，以促进即时检测并减少周转时间。

等温扩增为快速现场即时检测提供了有希望的解决方案，它简化了设备要求，并通过环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增、解旋酶依赖性扩增、链置换扩增和重组酶聚合酶扩增等方法实现目标序列的指数级扩增[13]。其中，LAMP利用Bst聚合酶和六个引物进行目标序列的链交换反应，在60-65°C下进行，扩增在1小时内完成[14]。与传统PCR相比，LAMP消除了对复杂热循环设备的需求，并对生物抑制剂具有更好的耐受性，使其特别适用于资源有限的场合[15]。

为了减少诊断周转时间，还需要从ABDF样本中高效提取SSI相关细菌的DNA并测量扩增产生的荧光信号。DNA扩增检测细菌病原体的灵敏度取决于细菌细胞裂解的效率（特别是对于革兰氏阳性细菌）以及从含有渗出液、血液或脓液的ABDF样本中提取DNA的复杂性[16]。目前市售的细菌DNA提取和纯化试剂盒价格昂贵且耗时，通常超过1小时。与从培养物中提取DNA不同，ABDF样本中的额外生物活性成分使得快速检测更加困难。

因此，为了即时检测ABDF样本中的SSI相关细菌，我们设计了一种基于优化CTL方法和冻干LAMP检测技术的Chelex-100热裂解（CTL）集成SSI-LAMP平台。该检测系统仅需约1小时即可完成这四种SSI相关细菌的SSI-LAMP检测，具有高灵敏度和特异性，为SSI的诊断和治疗提供了宝贵的临床指导。

试剂和仪器

Luria-Bertani（LB）肉汤/琼脂、酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基、Sabouraud葡萄糖琼脂（SDA）和Tween 80均从中国Solarbio公司购买。²⁺）、Bst 2.0 DNA聚合酶和脱氧核苷三磷酸（dNTPs）从中国Novoprotein Scientific Inc.公司购买。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）

CTL-SSI-LAMP平台原理

在这项研究中，提出了一种结合SSI-LAMP检测技术的快速CTL方法，用于即时检测ABDF样本中的常见SSI细菌。最终确定了四种高风险检测目标细菌：KP、AB、EFs和EFm。图1概述了所开发的方法，包括CTL方法和SSI-LAMP检测技术，整个过程大约需要1小时。首先，通过洗涤和离心预处理ABDF样本，然后进行涡旋处理

讨论

由革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌引起的SSI的发病率已成为发病率和死亡率的重要原因[1]，包括KP、AB、EFs和EFm。在ABDF样本中，传统的检测方法主要依赖于细菌培养，这种方法周转时间长且灵敏度低，随后是基于PCR的方法，这些方法需要昂贵的设备和专业人员。

结论

总之，由于传统的ABDF样本SSI检测方法存在局限性，我们开发了一种CTL-SSI-LAMP平台，通过将冻干SSI-LAMP检测技术与优化的CTL方法结合，能够在1小时内从ABDF样本中提取和检测细菌DNA。检测这四种SSI相关细菌的LOD均低于10³ CFU/mL，在模拟和真实的ABDF样本中均表现出优异的特异性和可靠的结果。

CRediT作者贡献声明

黄俊峰：撰写——审稿与编辑、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。黄伟：撰写——初稿、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。隋国栋：审稿与编辑、监督、资源获取、资金筹集。杨新荣：监督、资金筹集。王婷：监督、资金筹集。周健：监督、项目管理。杨柳晓：

利益冲突声明

作者们没有需要披露的利益冲突。

数据可用性

所有数据均包含在手稿中。

资助

本项工作得到了上海市科技重大项目（ZD2021CY001）、国家自然科学基金（82488101、82341027和82072715）、上海市卫生健康委员会项目（2022LJ005）、东部人才计划（重点项目）、上海市科学技术委员会项目（21140900300、22S31901800）、上海市医院发展项目的资助

利益冲突声明

作者们没有需要披露的利益冲突。

致谢

冻干LAMP试剂由中国苏州的Lyobead公司生产。手持式实时核酸检测仪器（HF-8T）由中国苏州的长河生物科技有限公司制造。