海洋肠杆菌（Enterobacter cloacae）BARC_01的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequence of marine Enterobacter cloacae BARC_01

海洋环境中分离的肠杆菌cloacae BARC_01完成基因组测序及分析，其与陆地致病株ATCC 13047的核苷酸和氨基酸相似度分别达98%和99.3%，携带丰富的耐药基因及质粒特征，提示人类活动可能引入陆地病原体至海洋环境。

　　

摘要

我们报告了从氯化海水冷却系统中分离出的海洋菌株Enterobacter cloacae BARC_01的完整基因组（CP183059.1）和质粒（CP183058.1）序列。该菌株与陆地致病参考菌株E. cloacae ATCC 13047在平均氨基酸和平均核苷酸水平上的同源性超过98%。

公告

Enterobacter cloacae是ESKAPE菌群中具有临床意义的一个成员，常与医院获得性感染（如肺炎和败血症）相关（1, 2）。虽然临床分离的E. cloacae复合体（ECC）成员已有大量研究，但环境中的分离株仍较少被关注。我们报告了从印度一家发电厂附近的沿海海水中分离出的E. cloacae BARC_01的完整染色体和质粒序列（rMLST匹配）。该菌株携带了丰富的耐药决定因子，与致病参考菌株E. cloacae ATCC 13047高度相似。

将分离出的单个细菌菌落接种到100毫升Zobell Marine肉汤（Hi-Media）中，在30°C和100 rpm的条件下于摇床中培养24小时。使用DNeasy PowerLyzer Microbial Kit（Qiagen）提取DNA。通过Tecan nanoplate读取器和Qubit High Sensitivity dsDNA Assay（Thermo）分别检测DNA的纯度和浓度。取1微克分离出的DNA直接用于使用Native Barcoding Kit 24（v14）（SQK-NBD114.24，Oxford Nanopore Technologies）进行文库制备，并在MinION流式细胞仪（R9.4.1）上进行测序。碱基呼叫使用Guppy（v6.5.7）的高精度模式完成。

我们获得了22,589条读段（平均长度4.9 kb，N50为12.9 kb）。使用Porechop工具修剪接头，并通过Flye（v2.9.6）3进行de novo组装，再通过Medaka pipeline（v2.1.1）https://github.com/nanoporetech/medaka进行优化。组装质量通过BUSCO验证（C: 95.2%，F: 3.2%，M: 1.6%；n = 124）。使用Prokka（v1.14.6）和RAST服务器4, 5进行注释。使用Proksee（6生成了环状基因组的可视化图（图1A）。利用BV-BRC平台6以及CARD、PATRIC、VFDB和TCDB数据库图1B鉴定了抗菌耐药基因、毒力因子和转运蛋白。

图1

图1 (A) Enterobacter cloacae BARC_01的环状基因组。(B) 在各种抗菌耐药数据库中检测到的阳性 hit数量以及E. cloacae BARC_01基因组中的主要基因。(C) E. cloacae BARC_01与E. cloacae ATCC 13047（参考菌株）的基因组比较（点图）。(D) E. cloacae BARC_01的环状质粒。

该质粒的长度为163,703 bp，GC含量为53%，包含116个假定编码序列，其中包括接合簇和重金属耐药基因图1D。其大小、GC含量以及移动遗传元件和耐药基因的组成与之前在临床ECC分离株中描述的IncHI类巨质粒特征一致7。

与E. cloacae ATCC 13047（CP001918.1）的比较基因组学分析表1显示，平均核苷酸同源性为98%，平均氨基酸同源性为99.3%。MUMmer（v4.0.0）点图比对图1C证实了高度的结构一致性，存在少量的菌株特异性重排8。这些发现表明E. cloacae BARC_01可能起源于陆地，并通过人类活动进入海洋环境，同时保留了显著的抗菌耐药潜力。

表1

特征类别	E. cloacae BARC_01	参考基因组（E. cloacae ATCC 13047/RefSeq NC_015663）
基因组大小/编码序列数	5,359个编码序列；总共5,623个特征	约5,200至5,500个编码序列
RNA元件	111个RNA基因	100–120个RNA
假想蛋白	约11.3%的编码序列	通常为10%–18%
CRISPR–Cas元件	7个cas基因，38个间隔区，40个重复序列	存在情况不定；许多参考菌株的CRISPR系统被截短
β-内酰胺酶基因（AmpC家族）	预测有5个位点	根据质粒载量不同，数量为1–5个
外排泵基因	约100个基因	通常为90–120个
移动元件/IS元件	50个转座酶样基因	有数十个常见类型
调控蛋白家族（LysR/AraC/TetR）	LysR: 55个 • AraC: 25个 • TetR: 6个	在肠杆菌科中普遍存在

致谢

作者感谢Shri Nitish Pandey在收集水样方面提供的帮助。同时，作者也衷心感谢水务与蒸汽化学部门负责人Dr. T.V. Krishna Mohan以及Dr. Y.V. Nanchariah在行政支持方面的协助。