《Current Opinion in Genetics & Development》：Emerging oligo-based imaging methods to study chromatin organization in cells and tissue
编辑推荐：
这篇综述系统梳理了近年在染色质三维构象研究中重新崛起的荧光原位杂交（FISH）技术，特别是基于寡核苷酸（oligo）探针的成像新策略。文章聚焦于Oligo-FISH技术的发展，详细阐述了其在染色质追踪、活细胞成像、谱系重建和光学池筛选（OPS）等新兴应用中的原理与进展，并对比了各种方法的优势与挑战。作者旨在为刚进入该领域的研究者提供一份全面的技术路线图，并对未来技术融合与标准化方向提出了展望。
在过去的几十年里，测序与成像技术的巨大进步彻底改变了我们对细胞核内染色质组织结构及其在发育与疾病中作用的理解。其中，成像方法近年来重新受到青睐，因为它们天然具备单细胞分辨率和可视化亚核空间距离与形态的能力。成像的一个突出优势在于其相对容易设计多模态实验，例如将DNA与RNA荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）染色相结合，以联合可视化基因组位点、转录本和蛋白质。
标记策略与信号扩增
荧光原位杂交（FISH）依赖于与细胞内互补靶序列结合的探针的荧光标记，从而可通过显微镜进行可视化。过去10-20年间，FISH工作流程的进步显著提升了检测的通量和应用范围，其中最关键的技术突破是转向计算机（in silico）设计的单链寡核苷酸（oligo）探针。在Oligo-FISH中，通常使用由数百至数千条未标记的寡核苷酸组成的初级探针池来靶向感兴趣的基因座，以实现高特异性的信号累积。与免疫荧光相比，FISH通常信号较弱，因为其检测依赖于更少的荧光团。这在高自发荧光样本中，或当基因座大小或重复性阻碍寡核苷酸设计时，可能成为问题。每个基因座的荧光团数量可以通过扩增策略来增加，例如通过成环（padlocking）来提高探针稳定性并实现原位滚环扩增（RCA），或者利用可变臂来结合信号放大器，如分支DNA（bDNA）FISH、信号交换反应扩增（SABER）和点击扩增FISH（ClampFISH）以及基于杂交链式反应（HCR）的技术。然而，扩增型FISH的一个缺点是倾向于增加假阳性率：即使只有少数几条杂交的寡核苷酸也能产生强信号。特异性可以通过需要两个相邻元件独立杂交才能产生荧光信号的分裂探针设计来改善。
染色质追踪与多重多模态FISH
当目标数量超过光谱可区分的荧光团时，就需要进行多重检测。在大多数多重FISH方法中，所有初级探针先进行杂交，然后迭代进行 i) 标记的读出寡核苷酸组的结合；ii) 成像；以及 iii) 读出寡核苷酸的剥离、荧光团切割或淬灭。染色质追踪是推动FISH工具包扩展的重要动力：它需要沿着同一条染色体对多个基因座进行DNA FISH，然后通过计算拟合信号来重建染色质纤维的高分辨率三维折叠路径。为了在全基因组范围内进行高分辨率的染色质追踪，需要更高的检测通量，下一代“高度多重”的追踪方法引入了原位条形码技术。顺序FISH（seqFISH）方法通过多轮成像顺序读取每个寡核苷酸上多个读出序列构成的条形码；而多重错误稳健FISH（MERFISH）则通过二进制条形码编码来稀释密集信号，实现高复用。为了减少光学拥挤（optical crowding），主要采用两种强制信号稀疏化的方法。最新的空间多组学方法，如双层DNA seqFISH+，通过巧妙的双阶段策略（首先对一半位点进行低重条形码成像，然后进行第二轮成像以区分剩余的位点组合）极大地减少了光学拥挤，实现了迄今最高的检测通量，同时结合了转录组和IF进行亚核结构分析。大多数多重DNA FISH方法已被整合到多模态设置中，用于DNA和RNA的联合可视化，并通过（顺序）IF分析核蛋白。相比之下，表观基因组MERFISH扩展通过使用Protein A-Tn5在组蛋白修饰附近标记DNA，然后进行原位转录（IST）并通过MERFISH或测序进行鉴定，实现了染色质标记的多重空间定位，其基因组分辨率（<1 kb）远优于IF。类似的，最近的Epi-PHR工作流程也实现了在细胞或组织切片中数百个目标位点上检测（多种）表观遗传标记，同时支持单倍型分型和染色质追踪，以揭示等位基因特异的染色质构象和表观遗传状态。
通过原位测序进行基因组成像
除了使用二级探针，条形码还可以通过原位测序（ISS）读取，这种方法提供碱基逐一读取，降低了对序列独特性的要求，并促进了快速且经济高效的解码。虽然ISS已广泛用于空间转录组学方法，但其在基因组成像中的应用发展较慢。先驱性的例子包括OligoFISSEQ（读取条形码化的DNA FISH探针）和原位基因组测序（IGS，在随机（Tn5辅助）整合和RCA后解码空间独特分子标识符UMI）。为了解决拥挤问题，IGS最近与扩张显微镜（ExM）在ExIGS中相结合。实际上，ExM作为一种通过样本膨胀来提高分辨率的手段已迅速普及。虽然IGS的分辨率受到衍射和核空间限制（限制了RCA的产量），但ExIGS中引入的均匀扩张将空间分辨率提升至超分辨/纳米尺度，同时通过扩大RCA空间提高了基因组分辨率。
保持三维形态与成像染色质动力学
在选择FISH方法时，重要的是要考虑 i) 保持空间、核及染色质形态的需要，以及 ii) 研究活细胞动力学的愿望。经典的（多重）DNA FISH涉及细胞固定和全基因组变性以促进寡核苷酸杂交，这可能至少在某种程度上影响全局和局部的三维染色质折叠。为了最小化这类伪影，已开发了几种结构保护方案。其中，RASER-FISH方法首先通过复制过程中掺入BrdU/BrdC引入DNA切口，随后进行固定、紫外光敏化和紫外照射。核酸外切酶介导的链切除将切口转变为单链DNA片段，从而实现了无需变性的DNA FISH探针杂交。与基于变性的FISH相比，RASER-FISH不受结构变异性的影响，并实现了从全染色体到纳米尺度的追踪。为了研究染色质动力学而非静态快照，已设计了多种活细胞DNA FISH方法，通常涉及作为寡核苷酸探针的荧光标记sgRNA来靶向基因座。除了信噪比和靶向非重复基因组区域的共同挑战外，活细胞FISH的通量通常限于少数几个位点。在最近的活细胞进展中，Oligo-LiveFISH可以高效、高特异性地在活细胞中同时标记和追踪2-3个非重复基因组位点的接触和动态。另一种完全无需工程化的方法CRISPR PRO-LiveFISH通过引入非天然碱基对和点击化学标记，扩大了sgRNA的多样性，实现了高灵敏度成像。TRACK-IT方法则使用Sleeping Beauty转座酶来移动染色体上两个并列的异位阵列之一，通过自动化显微镜和RNA-seq进行高通量筛选，实现了对阵列对的稳定、微型化荧光标记和超分辨率追踪。在更精细的尺度上，单核小体方法已经开始揭示活细胞的染色质运动。
利用寡核苷酸FISH进行谱系追踪
虽然活细胞成像能捕捉动态过程，但重建谱系关系需要时间记录系统，例如在细胞增殖和组织（重）构过程中发生突变的基因组整合“记忆条形码”。最初的记录系统MEMOIR依赖于随机且不可逆编辑的条形码，最近被扩展为baseMEMOIR，利用CRISPR A-to-G碱基编辑器将记忆容量提高了50倍。为了记录细胞历史过程中积累的单核苷酸编辑，baseMEMOIR利用了Zombie FISH，该方法使用原位转录来增强Zombie阶段的条形码信号检测。谱系追踪的最新进展PEtracer，使用了Prime Editing技术和多个5-nt的追踪标记，这些标记可通过scRNA-seq或RNA MERFISH读取，实现亚细胞分辨率的空间转录组学分析。
利用寡核苷酸FISH进行大规模扰动筛选
我们讨论的最后一个应用是光学池筛选，这是一种利用复杂CRISPR文库进行大规模功能基因组学筛选的技术。与基于测序的平台不同，OPS使用成像来评估许多细胞中的扰动效应。为了超越单细胞读数并捕捉空间组织的改变，最近的OPS平台将空间转录组学（高度多重RNA FISH）与原位sgRNA/CRISPR条形码识别相结合。为了同时测量全基因组表达，Perturb-Multimodal与Perturb-Seq平行，在匹配的组织切片上进行组织水平的RCA-MERFISH和多重IF，提出了迄今最全面的探究基因型-表型关系的平台。除了读取转录组和形态学效应，OPS也被用来识别生物过程的调控因子。例如，OPS-nFISH被设计用于研究端粒替代延长（ALT）途径的调节因子，依赖于端粒天然DNA FISH来检测端粒单链DNA（ssDNA），作为ALT活性的标志。此外，Perturb-tracing通过配对CRISPR池筛选、RCA和FISH条形码解码以及多尺度染色质追踪，记录了三维基因组的（失）组织状态，识别了21个三维基因组组织的新因子。另一项研究HiDRO则利用大规模RNA干扰（RNAi）筛选结合标记的初级寡核苷酸来量化三维染色质变化。
展望
FISH创新的步伐是惊人的：在短短一年内就涌现了大量新方法。未来我们期望看到该领域一些挑战的解决方案，包括：i) 开发更快速的高度多重FISH方法，因为顺序成像仍然非常耗时；ii) 对不同FISH方案可能造成的多尺度破坏性效应进行全面（最好是基于电子显微镜的）比较；iii) 进一步协调染色质追踪领域，以促进FISH-omics中数据的（再）可用性和整合。为了改进组学与光学的整合，我们认为那些校准组学发现与大规模活细胞成像的研究非常有价值。对于表观基因组成像方法，我们期望其在基因组覆盖范围上的改进，以及对FISH方法高亚核分辨率的进一步利用。此外，将其未来应用于转录因子可能会发现有趣的亚核结合模式。除了推进OPS技术以解密空间背景下的基因型-表型关系外，我们设想将其与时间记录系统整合，用于组织模式化的大规模扰动筛选。最后，我们看到需要能够跨越时间尺度探测三维基因组、形态和组织结构的技术创新，同时具备高分辨率和全基因组覆盖能力。
